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類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei,B.pseudomallei)是一種革蘭陰性菌，通常在流行地區(qū)如東南亞和澳大利亞北部熱帶地區(qū)的土壤和水中分離[1-2]。B.pseudomallei可通過破損皮膚、消化道和呼吸道傳播，經(jīng)常接觸該菌污染的土壤、水或者環(huán)境氣溶膠[3-4]，可導(dǎo)致動物和人類類鼻疽病。類鼻疽的臨床表現(xiàn)差異很大，可表現(xiàn)為無癥狀感染，局部皮膚膿腫，急性或慢性肺炎，關(guān)節(jié)感染或嚴重的全身敗血癥等[5]，其中感染性休克病例的死亡率高于90%[6]。B.pseudomallei作為類鼻疽的病原體，由于其非特異性臨床表現(xiàn)，缺乏有效的疫苗，對多種抗生素耐藥以及氣溶膠傳播的特性，再加上高死亡率等原因，已被美國疾病預(yù)防控制中心列為B類生物恐怖制劑和Ⅰ級病原微生物。

類鼻疽在海南全境均有發(fā)病，我們前期研究發(fā)現(xiàn)臨床病例和環(huán)境菌株分布主要集中在沿海周邊的地區(qū)，類鼻疽臨床病例為全國之最[7-8]。自2003年以來，多位點序列分型(MLST)已廣泛應(yīng)用于B.pseudomallei的分子流行病學(xué)研究[9]。MLST數(shù)據(jù)庫中顯示了澳大利亞ST36和ST109以及泰國ST70和ST93的主導(dǎo)地位，但是關(guān)于海南省B.pseudomallei的STs報道信息較少，該菌的遺傳多樣性以及與國外地區(qū)菌株的分子遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)并不清楚。本研究旨在對海南省B.pseudomallei臨床及環(huán)境分離株的STs分析，為類鼻疽病高發(fā)地區(qū)的診斷和分子流行病學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源及培養(yǎng) 2017年12月至2018年5月從海南醫(yī)學(xué)院附屬海南省醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和三亞市人民醫(yī)院收治的類鼻疽病患者中共獲得16株B.pseudomallei臨床菌株以及2株前期課題組采集的海南省環(huán)境分離株。將18株B.pseudomallei分別接種血平板和麥康凱平板, 置37 ℃培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)。

1.2MLST多位點序列 使用基因組提取試劑盒 (DNeasyBlood&Tissue Kit, Qiagen公司) 于二級生物安全實驗室提取菌株染色體DNA, 操作步驟詳見說明書。DNA經(jīng)PCR檢測鑒定為B.pseudomallei后[9]，置-20 ℃保藏備用，PCR擴增等位基因ace、gltB、gmhD、lepA、lipA、narK、ndh[10]。擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,共循環(huán)35次；最終72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物取5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物送生物公司測序。

1.3數(shù)據(jù)分析 對18株B.pseudomallei的MLST多位點序列測序結(jié)果進行分析，通過比較MLST網(wǎng)站(http://pubmlst.org/bpseudomallei/)的序列，確定了7個管家基因的等位基因數(shù)。7個數(shù)字由每個菌株的等位基因譜組成，并且每個不同的等位基因譜被指定為序列類型。根據(jù)序列類型，所有菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系均使用eBURST v.3(eburst.mlst.net/v3/mlst_datasets/)生成，數(shù)據(jù)庫B.pseudomallei的所有菌株的STs圖表用JAVA v.8.0輸出(https://java.com/en/download/faq/java8.XML)。

2 結(jié) 果

2.1菌株培養(yǎng) 18株B.pseudomallei在血平板上培養(yǎng)24 h后形成細小菌落, 48 h菌落生長至中等大小, 灰白色, 外形似車輪狀或菊花樣, 菌落周圍呈半溶血狀態(tài), 生長菌落的平板有濃烈的土霉氣味；在麥康凱平板上為分解乳糖的紅色菌落。

2.2細菌多樣性分析 細菌多樣性分析18株B.pseudomallei屬于12個不同的STs(表1)，其中本研究中發(fā)現(xiàn)一株B.pseudomallei的新STs為中國特有,由現(xiàn)有等位基因重配產(chǎn)生，數(shù)據(jù)提交后MLST網(wǎng)站將該基因型命名為ST1676。18株B.pseudomallei中ST50有4株，檢出率占22.2%，ST58、ST232、ST1094各檢出2株，其余ST各占1株。

在18個分離株中，ace，gltB，lepA，lipA和ndh基因只有2～3種變體，而narK和gmhD基因有5個種及以上的變體。除ST30、ST1090、ST1094和ST1676僅在中國報道之外，其他東南亞地區(qū)報道了剩余的8個ST，其中ST58、ST70、ST46在澳大利亞地區(qū)也報道過，不過澳大利亞地區(qū)報道的ST58和ST70可能是來自曾經(jīng)到過亞洲的旅行者。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析 迄今為止，全世界已鑒定出約1 676種序列類型(STs)，這反映了該物種內(nèi)的高度多樣性。MLST數(shù)據(jù)庫中，不同國家的ST分布顯示了澳大利亞ST36和ST109以及泰國ST70和ST93的主導(dǎo)地位。使用eBURST將12個ST與MLST數(shù)據(jù)庫中存在的所有ST進行比較，12個ST分布在eBURST圖的幾乎所有分支中，結(jié)果表明了海南省B.pseudomallei高度的多樣性，見圖1。

3 討 論

B.pseudomallei是導(dǎo)致獲得類鼻疽的主要病原體，在澳大利亞北部和東南亞地區(qū)廣泛流行，中國南方是類鼻疽報道的高發(fā)區(qū)，特別是在海南省[11-12]。類鼻疽是一種潛在的致命疾病，感染病人死亡率為10%～50%[13]。大多數(shù)B.pseudomallei感染是從環(huán)境中獲得的，如接觸受污染的土壤或地表水，而人與人之間的傳播非常罕見[13]。由于獲得類鼻疽病的傳播性質(zhì)，加上B.pseudomallei受限制的環(huán)境傳播模式，促進了具有有限地理分布的局部群體的遺傳與進化[14-15]。

MLST是一種通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段并測定其序列，操作簡單，結(jié)果能快速得到并且便于不同實驗室的比較，已經(jīng)用于多種細菌的流行病學(xué)監(jiān)測和進化研究[16]。MLST已成為一種既定的技術(shù)，可用于分離物的明確和精確表征以及流行病學(xué)研究。使用MLST的系統(tǒng)發(fā)育研究已經(jīng)鑒定了對應(yīng)于亞洲和澳大利亞的兩種不同的B.pseudomallei群體[14-15, 17-18]。對菌群結(jié)構(gòu)的分析促進了異常類鼻疽病病例的來源歸因，特別是那些發(fā)生在類鼻疽病不流行的地區(qū)[19]。

表1 18株類鼻疽伯克霍爾德菌的多位點序列類型
Tab.1 Multilocus sequence typing of 18Burkholderiapseudomallei

菌株信息MLST編號來源acegltBgmhDlepAlipAnarKndhSTBp-1臨床313314155Bp-3臨床146154130Bp-5環(huán)境315114158Bp-7臨床315114158Bp-9環(huán)境1213112911676Bp-13臨床32341111090Bp-14臨床3231131154Bp-15臨床1131131689Bp-16臨床122831931094Bp-17臨床312114350Bp-18臨床312114350Bp-19臨床11281143232Bp-20臨床122831931094Bp-21臨床3411354670Bp-22臨床11281143232Bp-23臨床312113346Bp-24臨床312114350Bp-25臨床312114350

注：12個STs之間的相關(guān)性使用eBURST v3軟件分析，下載B. pseudomallei所有的STs和等位基因圖譜，將數(shù)據(jù)與本研究的12個ST的數(shù)據(jù)進行比較。本研究中的新型ST1676用綠色圓圈表示;11種已經(jīng)報道過的STs用紫色圓圈表示；其余數(shù)據(jù)庫中ST用黑色點表示。圖1 類鼻疽伯克霍爾德菌株的多位點序列分布圖Fig.1 Multilocus sequence typing map of Burkholderia pseudomallei

一些等位基因在我們的研究中占優(yōu)勢，特別是ace-3、gltB-1、lepA-1、lipA-1、narK-4，這些發(fā)現(xiàn)表示等位基因內(nèi)的遺傳多樣性較低，但等位基因經(jīng)常重組以形成新的ST。gmhD是7個管家基因中變異最大的，本研究中g(shù)mhD有7個單基因座變體，這可能表明gmhD突變在中國B.pseudomallei菌株的進化中的作用，這個等位基因的變異可能是菌株ST的高遺傳多樣性的原因。

總之，來自海南的18個分離株具有高度多樣性。等位基因重組可能是導(dǎo)致這些多樣性的重要因素，人類的遷移也可能影響整個海南的B.pseudomallei克隆的分布。B.pseudomallei在流行地區(qū)的廣泛分布及其傳播性，使得未來海南省可能出現(xiàn)更多的類鼻疽病例。我們的研究發(fā)現(xiàn)了中國菌株新的STs出現(xiàn)，需要進一步對這種相對罕見的感染性菌株進行分子流行病學(xué)研究。