蘇戰(zhàn)強(qiáng)，孫 雪，翟少華，張 毅，佟盼盼，阿不力米提·沙吾提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

馬腺疫（equine strangles）俗稱噴喉，中獸醫(yī)稱槽結(jié)、喉骨脹，是由C群鏈球菌中的馬鏈球馬亞種（Streptococcus equisubsp）引起的一種馬屬動(dòng)物急性熱性、高度接觸性傳染病，所有馬屬動(dòng)物對(duì)其都易感，但馬最易感，騾和驢次之，尤以1～2歲馬多發(fā)[1]。Jorda-nus Ruffus 1251年報(bào)道了馬鏈球菌引起的馬疾病，通常稱為腺疫（strangles）。2017年前，腺疫是包括美國在內(nèi)許多國家最常報(bào)道的馬屬動(dòng)物疫病[2]。在我國，馬腺疫一年四季均會(huì)發(fā)生，呈散發(fā)性或地方性流行[3]。新疆是全國養(yǎng)馬數(shù)量最多的地區(qū)，有些地區(qū)的馬腺疫發(fā)病率高達(dá)80%～90%。王彩蝶等[4]報(bào)道，新疆昭蘇縣、特克斯縣、富蘊(yùn)縣、吉木乃縣的馬養(yǎng)殖區(qū)均有不同程度的馬腺疫鏈球菌感染。但馬鏈球菌導(dǎo)致驢發(fā)病的報(bào)道較少。本次疫情發(fā)生在新疆和田地區(qū)一驢養(yǎng)殖場。2018年該場陸續(xù)從山東省、河南省引進(jìn)關(guān)中驢和德種驢2種肉用驢（平均體質(zhì)量200～350 kg），3月份引進(jìn)公驢700頭，至6月該養(yǎng)殖場飼養(yǎng)規(guī)模已達(dá)8 000頭，5月中旬暴發(fā)疫病后，日死亡數(shù)量達(dá)20余頭，5月底病死驢已有500余頭，病因不詳，為此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌收集病死驢肺臟、肝臟、脾臟、腎臟和心血樣本。

1.1.2 材料及試劑 材料：潔凈的剪刀、鑷子、托盤、酒精燈、無菌試管、接種環(huán)、載玻片、培養(yǎng)皿等。主要試劑：革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion Broth BHI）、Mueller-Hinton瓊脂（MH）、LB固體培養(yǎng)基，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×Taq PCR Green Mix、ddH2O、16SrDNA通用引物等，購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管、法國科瑪嘉尿路菌群顯色培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；5%綿羊血平板，自制。主要儀器：自動(dòng)高壓滅菌器（HVE-50）、離心機(jī)（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、空氣浴振蕩培養(yǎng)箱（ST-F160AC）、SW-CJ-2F雙人雙面垂直潔凈工作臺(tái)，為上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；TProfes-sional PCR 儀，為Biometra公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，為UniversalHoodll Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 臨診診斷 觀察發(fā)病驢體溫、心跳、呼吸、可視黏膜、營養(yǎng)狀況等，結(jié)合問診進(jìn)行初步診斷。

1.2.2 剖檢診斷 剖檢病死驢，觀察并記錄臟器的結(jié)構(gòu)、大小、顏色，檢查有無出血等病理變化。

1.2.3 樣本觸片鏡檢 用鑷子夾取樣品內(nèi)部中心處組織，擦拭在載玻片上，按革蘭氏染色液使用方法進(jìn)行染色，用油鏡觀察。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 本次藥敏試驗(yàn)選擇10類共計(jì)30種藥敏片。蘸取適量菌液，用涂布棒均勻涂布于MH培養(yǎng)基后，貼上藥敏片。1個(gè)培養(yǎng)皿貼4～5片藥敏片為宜，放置好后37 ℃恒溫培養(yǎng)8～12 h，測量抑菌圈大小。

1.2.5 細(xì)菌分離純化 在超凈臺(tái)內(nèi)，用接種環(huán)蘸取菌液，以“Z”字形狀接種于5%綿羊鮮血平板、法國科瑪嘉尿路菌群顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～24 h，選取優(yōu)勢可疑菌進(jìn)行純化培養(yǎng)并革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.6 細(xì)菌16S鑒定 可疑菌落純化培養(yǎng)3代后，挑取單菌于BHI增菌培養(yǎng)，提取菌液DNA模板，參考細(xì)菌16SrDNA 通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：CGGTTACCTTGTTACGACTTC）擴(kuò)增片段，比對(duì)確定可疑菌種屬。PCR常規(guī)體系反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 5 m；變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠在20×TAE電泳液中電泳30 min，EB浸泡15 min，在凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。將清晰明亮條帶對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物，送鼎國生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，所得序列在BLAST上進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.7 生化試驗(yàn) 純培養(yǎng)可疑菌落，挑取同一平皿單菌于細(xì)菌微量生化鑒定管中37 ℃培養(yǎng)12～36 h，按說明書判讀，將結(jié)果與第8版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[5]比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 臨診癥狀

發(fā)病驢多消瘦，體溫升高（40～43℃），呼吸急促或困難，多為腹式呼吸，精神沉郁，食欲不振，渴欲增加；隨著病情發(fā)展，病驢陸續(xù)出現(xiàn)死亡，個(gè)別病驢鼻孔流出灰黃色分泌物（圖1），大部分驢被毛雜亂無光澤、消廋（圖2）。

圖1 發(fā)病驢鼻孔分泌灰黃色分泌物

圖2 病死驢消瘦、被毛雜亂

2.2 病理剖檢

消化系統(tǒng)：小腸腸管顯著充血、出血；腸系膜出血，血管擴(kuò)張、充血；結(jié)腸管腔顯著擴(kuò)張，腸壁緊張性增強(qiáng)，部分腸段淤血，腸道漿膜破裂，內(nèi)容物溢出；脾臟淤血、腫脹，表面有廣泛性灰白色粟粒大、結(jié)節(jié)狀增生（圖3）；

呼吸系統(tǒng)：支氣管黏膜充血，肺臟體積增大，表面顏色變淺，有肋骨壓痕，出血、充血擴(kuò)張，肺臟切面流出大量如醬油樣暗黑色液體（圖4）。

其他臟器：腎臟顏色暗紅、淤血、腫脹，腎髓質(zhì)部增寬，突出于腎臟內(nèi)側(cè)，皮質(zhì)部變窄，局部腎組織皮質(zhì)與髓質(zhì)界限不清（圖5）；肝臟色澤變淺，呈土黃色外觀，體積顯著增大，質(zhì)地變脆，邊緣淤血，呈暗紅色（圖6）。

圖3 病變脾臟

圖4 病變肺臟

圖5 病變腎臟

圖6 病變肝臟

2.3 樣本觸片鏡檢

將樣本直接觸片進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，發(fā)現(xiàn)著色不明顯，可見球型單菌（圖7）。

圖7 肺臟樣本觸片鏡檢結(jié)果（oil×100）

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果（表1）顯示，樣本對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物較敏感。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 單位：mm

2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)

通過接種綿羊血平板和法國科瑪嘉培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)樣本中僅有一種β溶血革蘭氏陽性球菌，溶血環(huán)直徑可達(dá)2 mm（圖8），且鏡檢形態(tài)與原始樣本觸片菌一致（圖9）。

2.6 細(xì)菌16SrDNA PCR鑒定

收集純菌落進(jìn)行16SrDNA PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在1 500 bp處出現(xiàn)明亮條帶；將測序結(jié)果在BLAST上進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與馬鏈球菌馬亞種和馬鏈球馬獸疫亞種同源性均達(dá)99%（圖10）。

2.7 生化鑒定

將生化指標(biāo)（表2）與《伯杰氏手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌更符合馬鏈球菌，而不是獸疫鏈球菌。經(jīng)過觸片鏡檢、菌株培養(yǎng)特點(diǎn)、16S測序、生化鑒定等試驗(yàn)，證明樣本內(nèi)的分離株為馬鏈球菌馬亞種。

圖8 樣本β溶血

圖9 革蘭氏陽性球型單菌鏡檢形態(tài)（oil×100）

3 治療

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，快速反饋當(dāng)?shù)孬F醫(yī)，選擇頭孢噻肟等藥物進(jìn)行治療，1周后驢場疫情得到控制。

4 討論

馬腺疫是由馬鏈球菌馬亞種引起馬、騾、驢的一種急性傳染病，臨診以發(fā)熱、呼吸道黏膜發(fā)炎、頜下淋巴結(jié)腫脹化膿、持續(xù)性單側(cè)或雙側(cè)流黏濃性鼻液為主要特征，這也是臨床馬腺疫的診斷要點(diǎn)[6]。由馬鏈球菌馬亞種引起的驢腺疫早有報(bào)道。1998年張八軍[7]報(bào)道了甘肅省一起驢腺疫疫情，發(fā)病驢有體溫升高、呼吸困難、淋巴結(jié)輕度腫脹，嚴(yán)重者淋巴結(jié)破潰流出膿液后體溫下降等臨診癥狀，與馬發(fā)生腺疫的臨診癥狀并無明顯差異。2002年也有報(bào)道，皮山縣驢場出現(xiàn)相似臨診癥狀的驢腺疫病例[8]，患病驢出現(xiàn)體溫升高、心跳加快、呼吸困難、食欲廢絕和分泌黏濃性鼻液為主的臨診特征，但是未出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大和潰爛等癥狀。淋巴結(jié)病變不明顯是該病診斷的難點(diǎn)。

圖10 16SrDNA PCR鑒定結(jié)果

表2 生化鑒定結(jié)果

剖檢該驢場病死驢，發(fā)現(xiàn)肺臟充血、出血，剖開肺臟發(fā)現(xiàn)流出暗紅色液體，肺臟病變較其他臟器更為嚴(yán)重。有報(bào)道[9]稱，馬鏈球馬亞種在影響肺功能方面起主要作用，會(huì)對(duì)畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。剖檢多有胃破裂現(xiàn)象。結(jié)合呼吸困難、心跳加快等臨診癥狀并結(jié)合剖檢診斷中肺臟功能減退的病理變化，認(rèn)為引起胃破裂的原因可能是發(fā)病驢呼吸困難，繼而衰竭時(shí)極度掙扎造成的。

將分離株測序結(jié)果在BLAST上比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該菌與馬鏈球馬亞種和馬鏈球獸疫亞種的同源性均達(dá)到了99%，無法區(qū)分。這時(shí)生化指標(biāo)就顯得尤為重要。參考馬鏈球菌馬亞種不能發(fā)酵山梨醇的特點(diǎn)[5]，最終確診該驢場病原菌為馬鏈球菌馬亞種。

合理的規(guī)劃養(yǎng)殖和潔凈的引進(jìn)來源是疫病防控的基礎(chǔ)。此次驢場發(fā)病與不合理的養(yǎng)殖規(guī)劃有不可分割的關(guān)系?，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，規(guī)劃的隔離觀察新引進(jìn)驢只的預(yù)備圈舍面積與引進(jìn)驢只數(shù)量差距較大。規(guī)劃每圈舍養(yǎng)殖不超過180頭，但實(shí)際每圈養(yǎng)殖密度高達(dá)200～500頭。密集養(yǎng)殖使該驢場出現(xiàn)了營養(yǎng)不均的問題，表現(xiàn)為弱小驢搶不到飼料、發(fā)育遲緩等。長途運(yùn)輸、擁擠、焦躁以及氣溫和環(huán)境的變化，使這些弱小驢首當(dāng)其沖，從而使馬腺疫成為隱患。此次疫情確診后，該驢場計(jì)劃接種相應(yīng)的疫苗，同時(shí)結(jié)合降低養(yǎng)殖密度、周圍環(huán)境消毒以及藥物治療等措施，逐步根除和凈化該病。該疫情也提示，該地區(qū)應(yīng)重視馬腺疫的危害，普及相關(guān)知識(shí)，做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)和早治療。