李清正，張振凌，閆夢真，孟冉

河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046

山萸肉為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，其味酸、澀，微溫，具有補益肝腎、收澀固脫之功。臨床常用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥。經(jīng)酒制后，補益肝腎作用增強[1]。山萸肉主要含環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機酸類、鞣質(zhì)類等成分。現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、抗炎、抗疲勞、降血糖、抗失血性休克和抗艾滋病[2]，還有促進學習記憶、防治骨質(zhì)疏松、抑制血小板聚集、保肝的作用[3]。目前，市場上流通的山茱萸主要炮制品種包括酒蒸山茱萸、蒸山茱萸、醋山茱萸、鹽山茱萸等，且以酒萸肉為主要品種[4]。

傳統(tǒng)山茱萸的產(chǎn)地加工方式多采用去核直接進行干燥得到山萸肉飲片，然而上述加工方式在保存過程中存在易變色、發(fā)黏、蟲蛀等弊端，且不同采收期山茱萸有效成分含量也有所不同，盡量保證在10月份最佳采收期進行采摘，因此亟需新的炮制方法進行優(yōu)化，以保障山茱萸飲片質(zhì)量[5]。歷代文獻對山茱萸的炮制工藝進行了詳細的描述，《本草述鉤元》云：“酒拌潤去核取皮，酒蒸一炷香[6]”；《活幼心書》云：“酒浸潤，蒸透，去核取皮為用[7]”；《增廣驗方新編》云：“酒浸、蒸、曬干[8]”；《炮炙大法》云：“酒拌，砂鍋上蒸去核了，一斤取肉皮用，只秤成四兩已來，凡蒸藥用柳木甄，去水八九寸水不犯上，余悉準此[9]”。由此可見，酒蒸制手段得到酒萸肉飲片，在保存過程中性質(zhì)穩(wěn)定。本研究根據(jù)古文獻的相關(guān)記載，結(jié)合飲片廠的實際生產(chǎn)需求，以干燥時間、干燥溫度、加酒量和蒸制時間為考察因素，采用4因素3水平的正交設(shè)計試驗，以馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸、5-羥甲基糠醛的含量和酒萸肉外觀性狀為評價指標，綜合評分優(yōu)選酒萸肉一體化炮制工藝參數(shù)，為酒萸肉飲片加工炮制一體化的實際生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters 1525高效液相色譜儀(上海通微分析技術(shù)有限公司)；Waters2487紫外檢測器；25 μL進樣針(SGE Analytical Science，Part 003300 25F-LC，25 μL Syringe)；Waters SunFire?C18色譜柱；BT25S型十萬分之一天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，Max=21 g，d=0.01 mg)；DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；BJ-150型高速多功能粉碎機(德清拜杰電器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；YP10002電子天平(上海衡際科學儀器有限公司，Max=1000 g，d=0.01 g)；蒸鍋；微電腦電陶爐(額定功率：2200 W)；一次性使用無菌注射器帶針(圣光醫(yī)用制品股份有限公司)；《中國藥典》篩(浙江上虞市五四儀器篩具廠)。

1.2 試藥

實驗用山茱萸新鮮果實購自河南南陽，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學張振凌教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的成熟果實。

沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、5-羥甲基糠醛對照品(成都普思生物科技有限公司，批號分別為：PS0258-0050、PS0500-0025、PS13031401、PS1517-0100)；黃酒；水為超純水；乙腈、甲醇均為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法的設(shè)計與比較

山萸肉在酒蒸過程中，環(huán)烯醚萜苷類成分馬錢苷和莫諾苷的含量會有不同程度的降低，因此在相同蒸制條件下，以山萸肉外觀性狀達到《中華人民共和國藥典》標準的蒸制最短時間為考察指標，設(shè)計了酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法，見表1～2。

表1 酒萸肉加工炮制一體化方法的設(shè)計與比較

表1中，按照每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min的方法進行蒸制，蒸制2 h后酒萸肉均為腐熟狀態(tài)，不能達到《中華人民共和國藥典》要求的外觀性狀，所以對一體化炮制工藝的方法進行改進。

表2 改進后酒萸肉加工炮制一體化方法的設(shè)計與比較

表2中，按照每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min，100 ℃條件下干燥2 h進行蒸制，并記錄山萸肉的外觀性狀，達到《中華人民共和國藥典》標準的時間。1號樣品蒸制時間在2 h達到《中華人民共和國藥典》標準，2號樣品在蒸制3 h，3號樣品在蒸制4 h后外觀性狀達到《中華人民共和國藥典》標準。2015版《中華人民共和國藥典》以馬錢苷和莫諾苷的含量為質(zhì)量控制指標。山茱萸飲片中馬錢苷和莫諾苷的含量隨著蒸制時間的延長有不同程度的降低[10]。因此，選擇1號樣品的蒸制條件作為酒萸肉一體化加工炮制方法。

2.2 酒萸肉產(chǎn)地加工一體化工藝參數(shù)的優(yōu)選

2.2.1 試驗設(shè)計 根據(jù)2.1項下酒萸肉產(chǎn)地加工一體化方法的結(jié)果，選取干燥溫度(A)、干燥時間(B)、加酒量(C)和蒸制時間(D)為考察因素，進行4因素3水平的正交試驗，結(jié)果見表3。按照正交試驗設(shè)計表制備酒萸肉樣品，取大小均勻的鮮山茱萸去核，分成9份，每份100 g，加入相應(yīng)量的黃酒浸潤30 min，攤開，放入烘箱，在80、90、100 ℃的條件下分別干燥1、2、3 h，取出放入蒸鍋內(nèi)蒸制。

表3 酒萸肉正交試驗設(shè)計因素水平表

2.2.2 外觀性狀評分 按照2015版《中華人民共和國藥典》[11]“山茱萸”項下“酒萸肉”外觀描述“表面紫黑色或黑色，質(zhì)滋潤柔軟，微有酒香氣”為評分標準，對9組實驗樣品外觀性狀評分。

2.2.3 沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、5-羥甲基糠醛的含量測定

2.2.3.1 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、5-羥甲基糠醛對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，用色譜甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.022、1.005、0.880、0.030 mg·mL-1的對照品母液。精密吸取各對照品母液0.50、2.00、2.00、1.00 mL，共置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為：0.051 1、0.201 0、0.176 0、0.003 0 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3.3 色譜條件 SunFire?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.1%磷酸-乙腈(A)梯度洗脫(0～5 min，2%～5%A；5～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～50 min，15%～45%A；50～60 min，45%～100%A；60～70 min，100%～2%A)；檢測波長：218 nm(沒食子酸)、240 nm(莫諾苷、馬錢苷、5-羥甲基糠醛)；柱溫：30 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1，色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.酒萸肉制品；1.沒食子酸；2.5-羥甲基糠醛；3.莫諾苷；4.馬錢苷。圖1 混合對照品和酒萸肉制品色譜圖

2.2.3.4 線性范圍的考察 分別精密吸取1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL混合對照品溶液，按照2.2.3.3項下色譜條件進行測定。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表4。

2.2.3.5 精密度試驗 將一定濃度的混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL，分別測得馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸和5-羥甲基糠醛的RSD為：0.34%、0.42%、0.37%和0.53%，表明儀器精密度良好。

表4 沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷、5-羥甲基糠醛4種成分的回歸方程及線性范圍

2.2.3.6 重復性試驗 精密稱定樣品0.2 g，共6份，按照2.2.3項下制備成供試品溶液，每次進樣10 μL，進行分析，測定沒食子酸、莫諾苷、馬錢苷和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為0.29%、0.61%、1.16%和0.68%。表明方法重復性良好。

2.2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、6、8、24 h分別進樣10 μL，測定馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸和5-羥甲基糠醛的峰面積的RSD分別為1.37%、1.23%、1.30%和1.34%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.8 加樣回收率 分別精密稱取沒食子酸、馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛對照品0.133、1.502、0.869、0.459 mg置10 mL容量瓶內(nèi)搖勻，作為對照品溶液，精密稱取已知含量的正交8號樣品0.1 g，共6份，每組按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部“藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”要求精密加入各對照品溶液，按照2.2.3.1項下制備供試品溶液，按照2.2.3.3項下色譜條件分別進樣測定，結(jié)果沒食子酸、馬錢苷、莫諾苷和5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率分別為98.42%、101.28%、98.37%、98.80%，RSD分別為0.61%、1.78%、0.75%、1.61%，表明該方法準確可靠。

2.2.4 含量測定 將樣品干燥，粉碎過三號篩，按照2.2項下方法測定馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸和5-羥甲基糠醛的含量。

2.2.5 結(jié)果分析 正交試驗結(jié)果以馬錢苷(A1)、莫諾苷(A2)、沒食子酸(A3)、5-羥甲基糠醛(A4)和外觀性狀(A5)5個指標進行綜合評價，用綜合指標評分法對正交試驗結(jié)果進行分析。馬錢苷和莫諾苷作為酒萸肉的指標性和有效成分，其含量對酒萸肉質(zhì)量控制有重要影響，故設(shè)定其權(quán)重系數(shù)分別為0.2，沒食子酸和5-羥甲基糠醛設(shè)定其權(quán)重系數(shù)為0.1，酒萸肉的外觀性狀權(quán)重系數(shù)為0.4。

綜合評分=0.2A1/A1max×100+0.2A2/A2max×100+0.1A3/A3max×100+0.1(0.183-A4)/A4max+0.4A5/A5max×100

(1)

綜合加權(quán)評分法評價結(jié)果見表6。

表5 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表6 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表7 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.000；*表示差異有統(tǒng)計學意義。

由表7可知，各因素對酒萸肉飲片產(chǎn)地加工一體化的影響順序是A>D>B>C，其中A因素具有顯著性。L9(34)試驗直觀分析的最佳工藝組合是A3B3C2D1，因此本實驗優(yōu)選的最佳工藝為：每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥。

2.3 最佳工藝驗證

取新鮮山茱萸，平均分成3份，每份1 kg，分別按照上述優(yōu)選的工藝(每100 kg去核鮮山萸肉加25 kg黃酒浸30 min至透，100 ℃干燥3 h后再蒸1 h，取出，干燥)對酒萸肉飲片中的馬錢苷、莫諾苷、沒食子酸、5-羥甲基糠醛和外觀性狀進行綜合評分，驗證一體化工藝的合理性，評分按照2.2.2項下進行綜合評分，結(jié)果見表8。

表8 最佳工藝驗證結(jié)果

由綜合評分結(jié)果可知，最佳工藝的平均得分為79.953，工藝驗證的RSD值為3.60%，以上結(jié)果表明，酒萸肉產(chǎn)地加工一體化炮制工藝穩(wěn)定可行，且馬錢苷和莫諾苷的含量高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的標準，為《中華人民共和國藥典》標準的3.79倍。

3 討論

山茱萸的傳統(tǒng)干燥方式主要有曬干和烘干兩種方法，無具體干燥工藝參數(shù)。酒萸肉的干燥溫度控制在80 ℃左右，將新鮮去核的山茱萸在100 ℃下干燥，這實際上已經(jīng)相當于酒山茱萸的蒸制過程，因此提高了干燥溫度就相當于縮短了酒萸肉的再次蒸制時間[12]，因此將干燥溫度水平分別設(shè)定為80、90、100 ℃。結(jié)合酒萸肉的外觀性狀，蒸制2 h其外觀性狀可達到《中華人民共和國藥典》標準，而傳統(tǒng)炮制方法制備的酒萸肉飲片一般4 h以上可達到《中華人民共和國藥典》要求，故將蒸制時間水平設(shè)定為1、2、3 h。

馬錢苷和莫諾苷為2015年版《中華人民共和國藥典》[11]中規(guī)定的酒萸肉的質(zhì)量控制指標。鄭雪花等[13]通過對沒食子酸的研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸具有抗高血壓、抗心肌梗死、抗血管鈣化、抗糖尿病、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和神經(jīng)保護作用，其含量經(jīng)炮制后明顯增加。5-羥甲基糠醛(5-HMF)具有抗心肌缺血、抗氧化作用，對急性小鼠肝損傷具有明顯的保護作用[14]。5-HMF為糖類加熱分解后的產(chǎn)物，經(jīng)加熱炮制后5-HMF的含量明顯增加。以上4種成分具有特有的藥理作用，因此我們選擇以上4種成分作為含量測定指標。

傳統(tǒng)山茱萸的產(chǎn)地加工方式多采用去核后直接干燥得到山萸肉，不同的炮制工藝對莫諾苷的含量有一定的影響，在產(chǎn)地加工炮制的全過程中耗費大量時間，而且制備酒萸肉飲片時，需加入黃酒再次進行浸潤，會造成有效成分的大量損失。與傳統(tǒng)酒萸肉飲片加工工藝相比，一體化加工工藝制備的酒萸肉飲片，于100 ℃的條件下干燥后蒸制1 h，而傳統(tǒng)酒萸肉加工蒸制時間為4 h，節(jié)省了大量的時間，并有效地保存了山茱萸中的有效成分。不同的炮制工藝對莫諾苷的含量有不同程度的影響[15]，本工藝中馬錢苷和莫諾苷含量高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的標準。以上結(jié)果表明，一體化工藝能夠縮短酒萸肉飲片的傳統(tǒng)加工炮制周期，降低貯藏保管難度，提高酒萸肉飲片質(zhì)量，且工藝簡單、穩(wěn)定、可行，可為酒萸肉飲片的一體化生產(chǎn)提供參考。