王云光 邵歡歡 單純玉

摘? 要： 電穿孔是脂質(zhì)膜在強(qiáng)電場作用下發(fā)生的一種現(xiàn)象，它是許多生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)。將電穿孔信號的參數(shù)通過優(yōu)化施加到特定的細(xì)胞、組織，以達(dá)到電穿孔的目的。電穿孔器是一種改變細(xì)胞膜通透性的脈沖發(fā)生器。在電穿孔的應(yīng)用中，我們通常控制和調(diào)整電穿孔脈沖發(fā)生器電場參數(shù)，以適應(yīng)特定的細(xì)胞參數(shù)和生物技術(shù)或生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，即電穿孔的目標(biāo)。電穿孔脈沖發(fā)生器的設(shè)計(jì)一直受到生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的驅(qū)動(dòng)。

關(guān)鍵詞： 電穿孔; 電穿孔器; 脈沖發(fā)生器; 電場

中圖分類號：TP301? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? 文章編號：1006-8228（2019）05-23-04

Abstract： Electroporation， a phenomenon of lipid membrane under strong electric field， is the basis of many biomedical technologies. The parameters of electroporation signal are applied to specific cells and tissues to achieve the purpose of electroporation. Electroporator is a pulse generator which changes the permeability of cell membrane. In the application of electroporation， we usually control and adjust the electric field parameters of electroporation pulse generator to adapt to specific cell parameters and the application of biotechnology or biomedicine， that is， the target of electroporation. The design of pulse generators for electroporation is always driven by biomedical applications.

Key words： electroporation; electroporator; pulse generator; electric field

0 引言

電穿孔是膜在足夠高的電場作用下發(fā)生的一種現(xiàn)象[1-2]。它是利用脈沖發(fā)生器所施加的外加電場，產(chǎn)生微秒、納秒甚至皮秒級電脈沖作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，從而形成納米級的細(xì)小孔道的過程。電穿孔的效果取決于許多物理和生物參數(shù)。這些參數(shù)可以分為電場參數(shù)[3-4]和細(xì)胞參數(shù)，這些參數(shù)定義了細(xì)胞的狀態(tài)、細(xì)胞的環(huán)境和細(xì)胞的幾何形狀[5-6]。在電穿孔的應(yīng)用中，我們通?？刂坪驼{(diào)整電場參數(shù)，以適應(yīng)特定的細(xì)胞參數(shù)和生物技術(shù)的應(yīng)用，即電穿孔的目標(biāo)。電穿孔分為可逆或不可逆兩種。可逆性或不可逆性與細(xì)胞存活/死亡有關(guān)?？赡骐姶┛卓蛇M(jìn)一步應(yīng)用于大、小分子的引入[7]、細(xì)胞的融合和蛋白質(zhì)的插入[8]。目前，電穿孔技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。破壞性的應(yīng)用程序依賴于的不可逆電穿孔技術(shù)早在20世紀(jì)60年代已提出。在過去十年中得到越來越多的關(guān)注，其功效是可觀的，尤其是在水處理領(lǐng)域，電滲透提高了化學(xué)處理的效果，在食品保藏中電滲透提高了食品的保鮮效果。在某些情況下，電滲透已被證明與巴氏殺菌或組織消融同樣有效[9]?；诳赡骐姶┛准夹g(shù)的應(yīng)用目前應(yīng)用更為廣泛，并在不同的實(shí)驗(yàn)和臨床方案中得到證明，其中比較成熟的兩項(xiàng)應(yīng)用是電化學(xué)[10]和基因轉(zhuǎn)染[11]。用于電穿孔研究的電穿孔脈沖振幅從mV到kV，頻率從Hz到MHz [12]。因此，在設(shè)計(jì)電穿孔脈沖發(fā)生器之前，重要的是要知道脈沖發(fā)生器將用于什么應(yīng)用。例如，對于某些應(yīng)用，一個(gè)非常簡單的電穿孔器就足夠了。然而，基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞電融合則需要輔助信號，如電泳信號和介電信號;多針電極需要電極換向器;細(xì)胞器的電穿孔需要非常短的脈沖，臨床應(yīng)用要求符合安全標(biāo)準(zhǔn)。單細(xì)胞電穿孔或平面脂質(zhì)雙層電穿孔需要低壓電穿孔脈沖[13]。細(xì)胞的體外和體內(nèi)電穿孔需要高壓脈沖。然而，細(xì)胞器、細(xì)菌或酵母的電穿孔需要更高的電壓。

1 電穿孔脈沖發(fā)生器

電穿孔的可重復(fù)性和有效性，在很大程度上取決于所施加的電穿孔信號是否可精確地再現(xiàn)。由于電穿孔過程是由脈沖發(fā)生器局部電場驅(qū)動(dòng)的，大多數(shù)情況下輸出電壓是可控的。脈沖發(fā)生器產(chǎn)生脈沖的特征是脈沖幅度和持續(xù)時(shí)間、脈沖數(shù)量、脈沖重復(fù)頻率和換向序列。

一個(gè)對電穿孔起關(guān)鍵作用的參數(shù)是電穿孔脈沖的持續(xù)時(shí)間。在短1μs的脈沖中，脈沖的上升時(shí)間通常短于源和負(fù)載之間的電長度。因此，負(fù)載阻抗與脈沖發(fā)生器阻抗匹配是非常重要的，這樣就不會產(chǎn)生強(qiáng)烈的脈沖反射，從而導(dǎo)致脈沖的延長。然而，對于脈沖超過1μs的，更重要的是要考慮負(fù)載阻抗在脈沖或采樣過程中發(fā)生變化，并且負(fù)載傳導(dǎo)沒有預(yù)先定義。另一個(gè)需要考慮的重要參數(shù)是脈沖形狀。對于非常高的電壓脈沖，由于高壓開關(guān)的工作是離散的，只能使用指數(shù)脈沖和方波脈沖。如果器件產(chǎn)生指數(shù)衰減脈沖，則時(shí)間常數(shù)和充電時(shí)間作為參數(shù)。如果設(shè)備產(chǎn)生方波脈沖，則給出脈沖長度和脈沖重復(fù)頻率作為參數(shù)。然而，對于較低的電壓，可以產(chǎn)生任意脈沖，因?yàn)檫@些電壓下的開關(guān)也可以線性運(yùn)行[14]?，F(xiàn)就目前電穿孔應(yīng)用中常用的兩種脈沖發(fā)生器，做一下闡述。

1.1 電容放電脈沖發(fā)生器

這是最早的電脈沖產(chǎn)生的概念，主要用于體外，但有時(shí)也用在體內(nèi)[15]。它產(chǎn)生的是指數(shù)衰減脈沖。它包括可變高壓電源（V）、電容器（C）、開關(guān)（S）和可選電阻（R）（圖1）。脈沖發(fā)生器工作在兩個(gè)階段，充電和放電，并產(chǎn)生指數(shù)衰減脈沖。充電階段，開關(guān)（S）位于1位，可變高壓電源（V）將電容器（C）充電至預(yù)設(shè)電壓。在放電階段，開關(guān)位于位置2，電容器通過連接到輸出端的負(fù)載放電。可以近似的放電時(shí)間常數(shù)τ等于ZLC，C是電容器的電容，|ZL|是負(fù)載阻抗的絕對值。然而，脈沖傳遞過程中生物負(fù)載阻抗降低[16]。這也意味著在脈沖過程中時(shí)間是恒定的。因此，大多數(shù)商用的基于電容器放電的電穿孔器都有與負(fù)載并聯(lián)的內(nèi)置電阻。其主要目的是為了更好地定義放電時(shí)間常數(shù)。也就是說，如果附加電阻與負(fù)載并聯(lián)，則放電時(shí)間常數(shù)由（R||ZL）C定義，其中R為內(nèi)部電阻。

一個(gè)Marx發(fā)生器（圖2），常用來產(chǎn)生無級衰減脈沖[17]。然而，電容器（C）通過電阻（R）并聯(lián)充電，然后，通過同時(shí)接通所有開關(guān)（S）通過負(fù)載（ZL）串聯(lián)放電。最大電壓負(fù)載ZL=VN，時(shí)間常數(shù)τ=|ZL| C/N（V為電源電壓，N為電容器數(shù)目）。

1.2 方波脈沖發(fā)生器

方脈沖發(fā)生器幾乎用于所有電穿孔的應(yīng)用，不僅因?yàn)樗唵?、?jīng)濟(jì)，而且它能夠很好地控制和再現(xiàn)有關(guān)的電氣參數(shù)。方波脈沖發(fā)生器與電容放電脈沖發(fā)生器非常相似，不同之處在于電壓電源（V）不斷給電容器（C）充電，而電源開關(guān)（S）能夠快速開關(guān)（圖3）[18]。通常采用快功率金屬氧化物半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管（MOSFET）或絕緣柵雙極晶體管（IGBT）作為開關(guān)。負(fù)載必須調(diào)整到脈沖形成網(wǎng)絡(luò)阻抗，以避免可變振幅傳遞到負(fù)載和脈沖反射。脈沖輸出幅值由可變電源的幅值確定，脈沖持續(xù)時(shí)間、脈沖重復(fù)頻率、可能的脈沖數(shù)由快速電源開關(guān)的開關(guān)頻率確定。由于開關(guān)速度更快、更復(fù)雜，脈沖發(fā)生器的控制單元也必須比指數(shù)脈沖發(fā)生器更快、更復(fù)雜。

Blumlein發(fā)生器（圖4）用于形成納秒方波脈沖。充電時(shí)開關(guān)S關(guān)閉，高壓電源V將輸電線路T1和T2充電至預(yù)設(shè)電壓。在放電過程中，開關(guān)被打開，傳輸線通過連接到輸出端的負(fù)載放電。為了產(chǎn)生沒有反射的方形脈沖，ZL必須是Z0的兩倍（Z0為傳輸線阻抗）。

2 電穿孔脈沖發(fā)生器研究現(xiàn)狀

電穿孔脈沖發(fā)生器在工業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的電穿孔脈沖發(fā)生器，一般采用空氣火花開關(guān)和 Blumlein 傳輸線產(chǎn)生脈沖電場。而微秒脈沖作為一種較容易實(shí)現(xiàn)的脈沖形式，一般采用電容作為儲能器件，由空氣火花開關(guān)直接放電產(chǎn)生脈寬為微秒級別的脈沖，如1.1節(jié)所述。但是由于空氣火花開關(guān)不能夠自行關(guān)斷，從而使得產(chǎn)生的脈沖一般為指數(shù)型式的衰減波。此外，輸出波形重復(fù)性欠佳，可控性差，壽命短，受負(fù)載影響大[19]，因此，很難適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。

近年來，隨著電力電子技術(shù)的不斷發(fā)展，IGBT、MOSFET及可關(guān)斷晶閘管等固態(tài)器件得到廣泛的應(yīng)用[20]。這些固態(tài)器件具有體積小、效率高、使用壽命長、工作重復(fù)頻率高、成本低、工作穩(wěn)定和維護(hù)簡單等優(yōu)勢[21]，在脈沖功率領(lǐng)域逐漸得到研究學(xué)者的關(guān)注。固態(tài)開關(guān)的功率容量與開關(guān)速度關(guān)系如圖5所示。由圖5可以看出，固態(tài)開關(guān)的工作速度與開關(guān)功率之間存在一定的矛盾關(guān)系[22]，因此在電穿孔脈沖發(fā)生器領(lǐng)域中，一般使用多個(gè)開關(guān)進(jìn)行串并聯(lián)或經(jīng)過一定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換以實(shí)現(xiàn)高壓大功率微秒脈沖輸出。對此，研究者也從未停止對電穿孔脈沖發(fā)生器的研究步伐。他們利用現(xiàn)代先進(jìn)的電力電子器件，積極投入電穿孔脈沖發(fā)生器的研制，以達(dá)到對電穿孔脈沖發(fā)生器參數(shù)的優(yōu)化。

Cronje.Thomas F等[23]采用一種級聯(lián)多電平逆變器拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的射頻MOSFET的高壓、高頻、雙極性脈沖發(fā)生器的設(shè)計(jì)，此設(shè)計(jì)，在80Ω電阻并聯(lián)235pf電容的負(fù)載情況下，輸出脈沖頻率高達(dá)1MHz，有5級電壓輸出，輸出電壓最高可達(dá)1.25kV。該脈沖發(fā)生器用于電化學(xué)治療和不可逆電穿孔。其脈沖機(jī)制是完全可編程的并且由FPGA控制。選擇了UCC37321柵極驅(qū)動(dòng)器和HCPL-2400光耦合器。采用阻尼電阻器和RCD緩沖電路來減輕輸出電路中的過度振鈴。Vitalij Novickij等[24]設(shè)計(jì)出一種高頻亞微妙脈沖發(fā)生器。他們利用同步Crowbar開關(guān)，實(shí)現(xiàn)了大功率方波單脈沖（3kv，60A）的輸出，方波脈沖的持續(xù)時(shí)間為100ns-1ms，預(yù)定義重復(fù)頻率為1Hz到3.5MHz。該電穿孔器成功地滅活了人類病原體白色念珠菌。Mohammad Samizadeh Nikoo[25]等研制了一種dsrd（漂移步進(jìn)恢復(fù)二極管）的兩級脈沖發(fā)生器結(jié)構(gòu)，在輸出端產(chǎn)生較高的峰值功率。從0.3W的平均輸入功率中獲得1.3kw峰值功率的重復(fù)納秒脈沖。最大輸出電壓為2.1kV，重復(fù)頻率為52Hz。上述電穿孔脈沖發(fā)生器均為方波脈沖發(fā)生器。

綜上所述可知，傳統(tǒng)電穿孔脈沖發(fā)生器由于體積龐大、穩(wěn)定性低、開關(guān)使用壽命短、工作頻率低、功率損耗大等原因，只能應(yīng)用于某些特定的領(lǐng)域。而基于全固態(tài)開關(guān)器件的電穿孔脈沖發(fā)生器工作頻率較高，可高達(dá)數(shù)kHz，甚至MHz，但是輸出脈沖電壓低。因此可根據(jù)現(xiàn)有的固態(tài)開關(guān)技術(shù)及電力電子技術(shù)對脈沖發(fā)生器進(jìn)行研制或改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)輸出參數(shù)的靈活可控，提高脈沖輸出電壓，并適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用。

3 展望

傳統(tǒng)的電穿孔技術(shù)是由脈沖發(fā)生器產(chǎn)生的脈沖驅(qū)動(dòng)的。如今，方波脈沖往往是首選。然而，隨著脈沖發(fā)生器變得越來越復(fù)雜，更復(fù)雜的波形是可能的。這些個(gè)別化或混合模式波結(jié)合了方波、指數(shù)波和正弦波信號的元素，為特定的應(yīng)用產(chǎn)生電穿孔脈沖發(fā)生器。未來新的電穿孔脈沖發(fā)生器將促進(jìn)一些靈活性類型的電穿孔脈沖設(shè)備的研發(fā)。在未來，研究者們將嘗試制造越來越短的電穿孔脈沖，并使用特殊的設(shè)備將脈沖應(yīng)用于生物負(fù)載。未來，他們利用電穿孔脈沖發(fā)生器治療人體腫瘤，而這一過程中獲得一些數(shù)據(jù)，可能有助于解決電穿孔是如何發(fā)生的。最后，新的電子元件將促進(jìn)脈沖發(fā)生器實(shí)現(xiàn)更高的電壓、電流輸出。

4 結(jié)束語

電穿孔脈沖發(fā)生器的設(shè)計(jì)一直深受生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的驅(qū)動(dòng)，同時(shí)電穿孔脈沖發(fā)生器也得到了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的高度重視和關(guān)注。本文對電穿孔脈沖脈沖發(fā)生器的設(shè)計(jì)進(jìn)行了研究，從電穿孔的應(yīng)用出發(fā)，對電穿孔脈沖發(fā)生器機(jī)理給出了闡述，對現(xiàn)階段電穿孔脈沖發(fā)生器的發(fā)展現(xiàn)狀做出了總結(jié)，并對未來電穿孔脈沖發(fā)生器的發(fā)展趨勢作出展望。多模態(tài)超短脈沖方波電穿孔脈沖發(fā)生器將成為未來的研究趨勢。

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