薛 蓓,侯 磊,薛會(huì)英

西藏農(nóng)牧學(xué)院,林芝 860000

土壤線蟲(chóng)是土壤動(dòng)物中的優(yōu)勢(shì)類群,被認(rèn)為是地球上數(shù)量最大的多細(xì)胞生物[1-2]。土壤線蟲(chóng)有多種食性,其功能(營(yíng)養(yǎng))結(jié)構(gòu)是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要決定因素之一,同時(shí)也能夠提供土壤腐屑食物網(wǎng)機(jī)能方面的信息,土壤線蟲(chóng)在草地生態(tài)系統(tǒng)中往往被看作是主要的消費(fèi)者,與草地生產(chǎn)力密切相關(guān)[3-7]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分離鑒定土壤線蟲(chóng)需要借助顯微鏡分辨,而且鑒定人員需要進(jìn)行專業(yè)的培訓(xùn),耗時(shí)耗力[8],例如從單個(gè)樣品中分離鑒定100—150個(gè)土壤線蟲(chóng)需要專業(yè)研究人員花費(fèi)1 h以上[9]。21世紀(jì)以來(lái),新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展日新月異,可直接測(cè)序 16S rRNA 基因的 PCR產(chǎn)物,每次分析獲得的基因序列數(shù)以百萬(wàn)甚至億萬(wàn)計(jì),不僅通量高,而且能夠同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品,是解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落物種組成和相對(duì)豐度的重要工具[10-11]。

目前,高通量技術(shù)在線蟲(chóng)研究中得到了一定的應(yīng)用[12],如國(guó)外學(xué)者對(duì)熱帶雨林和北極地區(qū)的線蟲(chóng)多樣性[13]、地中海灌木叢線蟲(chóng)多樣性[14]的研究以土壤活線蟲(chóng)作為一種生物指標(biāo),研究分析外來(lái)植物在沿海沙丘生態(tài)系統(tǒng)中的侵襲作用[15]、熱帶和溫帶雨林的線蟲(chóng)空間和生態(tài)模式[16]和熱帶雨林生物多樣性[17]等。國(guó)內(nèi)如馮陳晨等對(duì)駱駝斯氏副柔線蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序及分析[18]。

本文通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù),在 97%的相似水平下對(duì)所測(cè)得序列進(jìn)行OUT聚類和生物信息學(xué)分析,研究藏北高寒草甸不同土壤深度線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)特征,目的是全面了解高寒草甸不同深度土壤線蟲(chóng)群落多樣性,為進(jìn)一步研究不同植被不同氣候變化下土壤線蟲(chóng)群落特點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)樣地設(shè)置在西藏大學(xué)-中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所那曲生態(tài)環(huán)境綜合觀測(cè)研究站內(nèi)(31°31′38″—31°32′02″N,92°04′03″—92°04′16″E),采樣區(qū)域土壤為高山草甸土,其地被植物主要優(yōu)勢(shì)種及亞優(yōu)勢(shì)種有高山嵩草(Kobresiapygmaea)、矮火絨草(Leontopodiumnanum)、矮生嵩草(K.humilis)、二裂委陵菜(Potentillabifurca)、釘柱委陵菜(P.saundersiana)、乳白香青(Anaphallislactea)等[19]。

1.2 樣品采集

2017年8月,在實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地內(nèi)設(shè)置 3個(gè)六邊形樣地(3個(gè)重復(fù)),樣地面積均為2.5 m×2.5 m,每個(gè)六邊形樣地間距大于100 m。2017年8月,采用三點(diǎn)采樣法,分別采集0—5、5—10、10—15、15—20、20—25 cm 5個(gè)深度的土層原狀土樣,裝入無(wú)菌采樣袋中,放入冰盒內(nèi),于12 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱內(nèi)保藏備用。將樣品按照不同深度進(jìn)行樣品編號(hào),0—5 cm的土壤樣品編號(hào)為ZBCD1,5—10 cm的土壤樣品編號(hào)為ZBCD2,10—15 cm的土壤樣品編號(hào)為ZBCD3,15—20 cm的土壤樣品編號(hào)為ZBCD4,20—25 cm的土壤樣品編號(hào)為ZBCD5。各樣品含水率等理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

ZBCD：藏北草地的漢語(yǔ)拼音首字母簡(jiǎn)寫(xiě)；同列數(shù)據(jù)小寫(xiě)字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

1.3 DNA 抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè),利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；參考文獻(xiàn)[10],采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物,參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)上進(jìn)行在線分析(www.i-sanger.com)。其他數(shù)據(jù)處理采用SPSS20軟件。測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI(NT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及OTU組成分析

測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2,從表2可以看出通過(guò)對(duì)藏北草甸土壤不同深度各樣品中線蟲(chóng)基因測(cè)序,5個(gè)樣品總計(jì)測(cè)得原始序列條數(shù)為(182612±4463)條,質(zhì)控序列總數(shù)為(182164±977)條,共產(chǎn)生990個(gè)OTU。其中ZBCD2(5—10 cm)樣品中的OTU最多,達(dá)到了214個(gè)OTU,ZBCD3(10—15 cm)樣品中的OTU最少,僅為157個(gè)。

表2 樣品間測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Sequence data statistics of samples in different fermentation processes

同列數(shù)據(jù)小寫(xiě)字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

以多樣性指數(shù)為sobs(表征實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)目)做稀釋曲線如圖1。從圖1可知,5個(gè)樣品的稀釋曲線均基本趨于平緩,說(shuō)明所得序列可基本反映真實(shí)環(huán)境中土壤線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)。

圖1 不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)測(cè)序的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil nematodes communities in different soil compartmentsZBCD：藏北草地的漢語(yǔ)拼音首字母簡(jiǎn)寫(xiě)

圖2 不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)群落 OTU韋恩圖Fig.2 OTU Venn diagram of soil nematodes communities in different soil compartments

不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)群落OTU韋恩圖如圖2,共同含有的OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。從圖2可知,5個(gè)樣本中共同含135個(gè)OTU,其中ZBCD1(0—5 cm)獨(dú)有23個(gè)OTU,ZBCD2(5—10 cm)獨(dú)有21個(gè)OTU,ZBCD3(10—15 cm)獨(dú)有11個(gè)OTU,ZBCD4(15—20 cm)獨(dú)有25個(gè)OTU,ZBCD5(20—25 cm)獨(dú)有28個(gè)OTU,分別占總各自O(shè)TU總數(shù)的14.56%、13.46%、7.53%、15.63%和17.18%。

2.2 樣品間Alpha多樣性分析

各樣品中的Alpha多樣性指標(biāo)如表3。由表3可以看出,不同深度線蟲(chóng)群落樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)中的Chao1指數(shù)、Ace 指數(shù)差異顯著(P<0.05)；Shannon指數(shù)在ZBCD1和ZBCD5間差異不顯著(P>0.05),而這兩組樣本和其他三組之間Shannon指數(shù)差異顯著(P<0.05)。Shannon值最高的ZBCD2(5—10 cm)樣品除了具有較高的群落多樣性以外,其Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)分別為285.27±17.71和294.47±30.96,具有較高的群落豐富度。

2.3 綱水平各樣本土壤線蟲(chóng)群落分布圖

綱水平各樣本土壤線蟲(chóng)群落分布圖如圖3。從圖3可知,在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中刺嘴綱(Enoplea)是優(yōu)勢(shì)土壤線蟲(chóng)群落,分別占到各樣本線蟲(chóng)群落的72.13%、80.51%、76.79%、54.72%和77.90%；其次為色矛綱(Chromadorea),在ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3、ZBCD4、ZBCD5中分別占到各樣本線蟲(chóng)群落的17.54%、12.04%、12.62%、28.13%和16.92%,位于第3位的是在未分類的線蟲(chóng)綱(unclassified_p_Nematoda),在ZBCD4中相對(duì)含量最高,為17.15%。

2.4 目水平上不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)相對(duì)豐度

目水平各樣本土壤線蟲(chóng)群落分布圖如圖4。從圖4可知,在5個(gè)樣本中屬于土壤線蟲(chóng)的群落目分別是矛線目(Dorylaimida)、墊刃目(Tylenchida)、未分類的線蟲(chóng)目(unclassified_p_Nematoda)、三矛目(Triplonchida)、小桿目(Rhabdtida)、刺嘴目(Enoplida)和疏毛目(Araeolaimida)這7個(gè)目。其中矛線目(Dorylaimida)在5個(gè)樣本中含量均較高,其在ZBCD2中的相對(duì)豐度最高,含量為79.49%,其在ZBCD4中的相對(duì)豐度最低,含量為48.13%；刺嘴目(Enoplida)在ZBCD4中的相對(duì)豐度較高,含量分別為22.72%；三矛目(Triplonchida)在ZBCD4和ZBCD5中相對(duì)豐度較高,含量分別為6.59%和7.83%。

表3 樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Table 3 Alpha diversity in different sample

ZBCD：藏北草地的漢語(yǔ)拼音首字母簡(jiǎn)寫(xiě)；同列數(shù)據(jù)小寫(xiě)字母不同表示土層間差異顯著(P<0.05)

圖3 綱水平上不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)分布圖Fig.3 Frequence of Class level in soil nematode communities from samples

圖4 目水平上不同區(qū)組土壤線蟲(chóng)差異檢驗(yàn)柱形圖Fig.4 Frequence of Order level in soil nematode communities from samples

2.5 聚類分析

屬水平的各樣本土壤線蟲(chóng)群落TOP50熱圖分析見(jiàn)圖5。從圖5樣品間屬水平的聚類關(guān)系可知,ZBCD2和ZBCD3群落組成是最相似的,ZBCD5、ZBCD4、ZBCD1、ZBCD2和ZBCD3群落的組成相似性有一個(gè)遞增的趨勢(shì)。熱圖中共顯示30 個(gè)土壤線蟲(chóng)屬,分別為Melenchus(劍尾墊刃屬)、Meloidoderita(無(wú)對(duì)應(yīng)中文)、Ecphyadophora(突腔唇屬)、Prismatolaimus(棱咽屬)、Tylenchus(墊刃屬)、Clavicaudoides(無(wú)對(duì)應(yīng)中文)、Tylencholaimus(墊咽屬)、unclassified_p_Nematoda(未分類的線蟲(chóng)屬)、Acrobeloides(擬麗突屬)、Paravulvus(無(wú)對(duì)應(yīng)中文)、Aphelenchus(滑刃屬)、Odontolaimus(齒咽屬)、Hoplolaimus(紐帶屬)、Paratrichodorus(擬毛刺屬)、Filenchus(絲尾墊刃屬)、Alaimus(無(wú)咽屬)、Aphelenchoides(類滑刃屬)、Merlinius(默林屬)、Dorylaimellus(牙咽屬)、Meloidogyna(根結(jié)線蟲(chóng)屬)、Pratylenchus(短體屬)、Longidorus(長(zhǎng)針屬)、Acrobeles(麗突屬)、Aglenchus(野外墊刃屬)、Cylindrolaimus(筒咽屬)、Ditylenchus(莖屬)、Belonolaimus(刺屬)、Proleptonchus(原細(xì)齒屬)、Ecumenicus(通俗屬)、Rhabdolaimus(桿咽屬)。Tylencholaimus(墊咽屬)在5 個(gè)樣本中相對(duì)含量較高,ZBCD5共檢測(cè)到30 個(gè)屬,ZBCD1、ZBCD2、ZBCD3和ZBCD4分別共檢測(cè)到23、24、19、22個(gè)屬。

圖5 不同樣品間的土壤線蟲(chóng)heatmap圖Fig.5 Heatmap of the soil nematodes in different samples Melenchus：劍尾墊刃屬、Meloidoderita：無(wú)對(duì)應(yīng)中文、Ecphyadophora：突腔唇屬、Prismatolaimus：棱咽屬、Tylenchus：墊刃屬、Clavicaudoides：無(wú)對(duì)應(yīng)中文、Tylencholaimus：墊咽屬、unclassified_p_Nematoda：未分類的線蟲(chóng)屬、Acrobeloides：擬麗突屬、Paravulvus：無(wú)對(duì)應(yīng)中文、Aphelenchus：滑刃屬、Odontolaimus：齒咽屬、Hoplolaimus：紐帶屬、Paratrichodorus：擬毛刺屬、Filenchus：絲尾墊刃屬、Alaimus：無(wú)咽屬、Aphelenchoides：類滑刃屬、Merlinius：默林屬、Dorylaimellus：牙咽屬、Meloidogyna：根結(jié)線蟲(chóng)屬、Pratylenchus：短體屬、Longidorus：長(zhǎng)針屬、Acrobeles：麗突屬、Aglenchus：野外墊刃屬、Cylindrolaimus：筒咽屬、Ditylenchus：莖屬、Belonolaimus：刺屬、Proleptonchus：原細(xì)齒屬、Ecumenicus：通俗屬、Rhabdolaimus：桿咽屬

2.6 線蟲(chóng)群落與土壤化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

圖6為不同深度藏北草甸土壤門(mén)水平微生物群落與土壤化學(xué)指標(biāo)(表1)關(guān)系,第一主軸和第二主軸對(duì)土壤線蟲(chóng)群落相對(duì)豐度方差的解釋比例分別為38.64%和17.18%,兩者共解釋55.82%的方差變化。第一主軸上,K(K+)和HSL(含水率)是主要的影響因子,相關(guān)系數(shù)分別-0.81和-0.97,差異顯著(P<0.05)。第二主軸上,YJZ(有機(jī)質(zhì))和Zn(Zn2+)是主要的影響因子,相關(guān)系數(shù)分別為-0.92和-0.91,差異不顯著(P>0.05)。綜上,與不同深度藏北草甸土土壤門(mén)水平微生物群落相關(guān)性較大的土壤化學(xué)指標(biāo)是K+、含水率、有機(jī)質(zhì)和Zn2+。K+與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)有較強(qiáng)正相關(guān)性,與子囊菌門(mén)(Ascomycota)、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)、擬桿菌門(mén)(Phragmoplastophyta)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)負(fù)相關(guān)；含水率與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)、擬桿菌門(mén)(Phragmoplastophyta)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)正相關(guān),與子囊菌門(mén)(Ascomycota)和環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)負(fù)相關(guān)；有機(jī)質(zhì)與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)、擬桿菌門(mén)(Phragmoplastophyta)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)正相關(guān),與環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)負(fù)相關(guān)；Zn2+與擬桿菌門(mén)(Phragmoplastophyta)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)正相關(guān),與環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)無(wú)相關(guān)性,與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)負(fù)相關(guān)。

圖6 門(mén)分類水平土壤線蟲(chóng)群落與土壤化學(xué)指標(biāo)的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of soil nematode phyla and chemical parameters

3 討論與結(jié)論

研究區(qū)域地處青藏高原凍土帶,其草地植被的植物區(qū)系、形態(tài)、生理生化都具有典型的高原特點(diǎn)。凍土能敏感地反映氣候變化,季節(jié)性凍土則因周期性的凍融交替,顯著地影響著土壤生物的種群和群落特征[21]。本研究通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)鑒定到的藏北高寒草甸(盛長(zhǎng)期)(高山嵩草群落)土壤線蟲(chóng)類群屬數(shù)高于通過(guò)傳統(tǒng)鑒定手段得(藏北高山嵩草群落)到2綱6目[21],運(yùn)用該技術(shù)研究藏北高山嵩草線蟲(chóng)群落還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

(1)高通量測(cè)序結(jié)果表明藏北高山嵩草(盛長(zhǎng)期)5個(gè)土壤樣品中的(990±58)個(gè)OTU分屬于1個(gè)門(mén),3個(gè)綱,7個(gè)目,25個(gè)科,30個(gè)屬。刺嘴綱(Enoplea)、色矛綱(Chromadorea)是藏北高山嵩草平均相對(duì)豐度最高的綱,其中刺嘴綱(Enoplea)在ZBCD2(5—10 cm)中相對(duì)含量最高,達(dá)到80.51%,色矛綱(Chromadorea)在ZBCD4(15—20 cm)中對(duì)含量最高,達(dá)到28.13%。從0—25 cm的5份土壤樣本中共同含有135個(gè)OTU,其中ZBCD5(20—25 cm)獨(dú)有28個(gè),高于5—20 cm4個(gè)樣本中獨(dú)有的OUT數(shù)。

(2)不同深度藏北高山嵩草(盛長(zhǎng)期)線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較大的土壤化學(xué)指標(biāo)是K+、含水率、有機(jī)質(zhì)和Zn2+。其中K+、含水率、有機(jī)質(zhì)與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)有較強(qiáng)正相關(guān)性,而Zn2+與線蟲(chóng)門(mén)(Nematoda)的呈現(xiàn)較強(qiáng)負(fù)相關(guān)性。而線蟲(chóng)中食細(xì)菌性線蟲(chóng)和食真菌性線蟲(chóng)所占比例較大,通過(guò)分析與土壤中擬桿菌門(mén)(Phragmoplastophyta)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)。

藏北地區(qū)地處青藏高原腹地,氣候干寒,是全球氣候變化的敏感地帶,是藏北地區(qū)面積最大、最重要的生態(tài)系統(tǒng),其間廣泛分布的高寒草甸類草地具有典型的區(qū)域代表性,其中高山嵩草群落作為最具代表的植被類型,其區(qū)系、形態(tài)、生理生化能較好的反映氣候環(huán)境變化[3-7]。本研究通過(guò)當(dāng)下熱門(mén)的微生物生態(tài)學(xué)研究技術(shù)—高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)研究土壤線蟲(chóng)。傳統(tǒng)的土壤線蟲(chóng)研究方法是基于線蟲(chóng)的直接分離鑒定來(lái)分析環(huán)境中的線蟲(chóng)的群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)關(guān)系的,但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分離鑒定土壤線蟲(chóng)需要借助顯微鏡分辨,而且鑒定人員需要進(jìn)行專業(yè)的培訓(xùn),耗時(shí)耗力,傳統(tǒng)的分離鑒定手段一直難以讓人們?nèi)媪私猸h(huán)境中線蟲(chóng)的群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)關(guān)系。21世紀(jì)以來(lái),DNA測(cè)序技術(shù)取得革命性突破,新一代高通量測(cè)序16S rRNA基因極有可能成為一種常規(guī)手段分析土壤微生物的物種多樣性變化規(guī)律,成為土壤質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)方法。高通量測(cè)序法具有分析樣本量多、單個(gè)樣品序列通量高的優(yōu)點(diǎn),高通量測(cè)序能夠較為全面和準(zhǔn)確的反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[10,22]。

本文是以本課題組在藏北高寒草甸開(kāi)展了數(shù)年的土壤線蟲(chóng)群落研究為基礎(chǔ),采用NF15′-GGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTT-3′和18Sr2bR 5′-TACAAAGGGCAGGGACGTAAT-3′引物通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù),在97%的相似水平下對(duì)所測(cè)得序列進(jìn)行OUT聚類和生物信息學(xué),以獲得土壤線蟲(chóng)群落在不同深度的分布情況,并試圖將所獲得的結(jié)果與環(huán)境條件(水分含量、化學(xué)性質(zhì)等)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)不同深度土壤線蟲(chóng)種類及豐度存在一定的差異,為下一步研究不同植被以及不同氣候條件下的土壤線蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征提供方法上的有力支持。