張 沛，闞 威，張總超，馬艷萍，王謝忠，孫生禎，劉蓉婧，游蕭倩，拉 華，張茂華，魏夢(mèng)君，黃 龍，俞慧民，王云平*

（1.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海西寧810000；2.青海省樂都區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海互助810700）

近年來兔球蟲病和大腸桿菌病的混合感染病頻頻爆發(fā),兩病的混合感染使病情復(fù)雜化,病死率增高，給養(yǎng)兔業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于兔的腸上皮細(xì)胞和肝膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的一種寄生蟲病,是家兔養(yǎng)殖中最常見的寄生蟲病之一。按球蟲的種類和寄生部位不同可將兔球蟲病分為肝型、腸型和混合型，臨床常已混合型為主，表現(xiàn)為頑固性下痢、腹瀉帶血、腹圍增大、下垂，其主要侵害6月齡以內(nèi)兔，感染率可達(dá)100%，其中對(duì)1～3月齡的兔侵害最嚴(yán)重，死亡率可高達(dá)80%[1]。而兔大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的兔敗血型感染和腹瀉傳染病，表現(xiàn)為黏液性腸炎、腸毒血癥或組織器官炎癥等。臨床主要以下痢和流涎為特征，主要發(fā)生于1～4月齡仔兔。當(dāng)飼養(yǎng)管理不當(dāng)、氣候環(huán)境突變或患某些傳染病、寄生蟲病引起抵抗力低下時(shí)發(fā)病，該病可經(jīng)消化道傳播引起大批死亡[2]。

2018年9月底至10月初，青海省樂都區(qū)某兔專業(yè)養(yǎng)殖合作社兔發(fā)生了以拉稀、腹部臌脹、消瘦、呼吸困難等癥狀為主的疫情,并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，病程多在1～2 天。通過了解發(fā)病情況，送檢瀕死期兔臨床癥狀觀察，死亡兔剖檢變化和實(shí)驗(yàn)室診斷，為盡快確診并及時(shí)控制疫情，對(duì)病死兔進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定和糞便蟲卵檢查，并通過動(dòng)物試驗(yàn)確定其毒力，最終確診為球蟲病與大腸桿菌病混合感染。同時(shí)對(duì)分離株細(xì)菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以便對(duì)樂都區(qū)兔大腸桿菌的臨床診斷和抗菌藥物治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢材料

送檢已死亡和瀕死期兔各1 只。剖檢檢測(cè)已死亡兔，并無菌采集心、肝、脾、肺等臟器和糞便作為試驗(yàn)檢測(cè)病料；對(duì)瀕死期兔進(jìn)行臨床觀察。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、HE 瓊脂培養(yǎng)基、K-B 法藥敏紙片（26 種）；細(xì)菌微量生化鑒定管，0.5 麥?zhǔn)媳葷峁埽?gòu)自于杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒、2000DNA Marker、PCR 反應(yīng)預(yù)混酶、50×TAE、瓊脂糖，購(gòu)自于北京全式金公司。

設(shè)備：顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 擴(kuò)增儀(Bio-RAD，Mexico)，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD，USA），水浴恒溫振蕩器，DYY-12 型電腦三恒多用電泳儀與DYCP-31A 型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

18g～22g SPF 級(jí)小鼠，購(gòu)自青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 引物合成

參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[3]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成細(xì)菌鑒定用通用引物16S rRNA基因引物，引物序列及大小，見下表1。

表1 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 病料觸片鏡檢和糞便蟲卵檢查

將剖檢兔采集的病料組織心、肝、肺病理變化部位觸片后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

取新鮮兔糞5～10g 放入杯中，先加少量飽和鹽水將兔糞搗爛混勻，再加飽和鹽水至50ml。將此糞液用60 目尼龍網(wǎng)過濾于試管（15㎜×150㎜），在試管凸液面覆蓋蓋玻片，靜止15～30 分鐘，球蟲卵即浮于凸液面，隨即取下蓋玻片置于載玻片上，在顯微鏡10X40 倍觀察。

1.2.2 小動(dòng)物試驗(yàn)

將采集的病料組織（心、肝、肺）分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)，取其24 小時(shí)培養(yǎng)物，分別腹腔接種18～22gSPF 級(jí)小鼠4 只，每只0.2ml；同時(shí)取4 只同級(jí)別小鼠注射等量無菌生理鹽水作為對(duì)照，隔離飼養(yǎng)觀察。

1.2.3 病原分離培養(yǎng)

無菌采集死亡小鼠的心臟、肝臟、肺臟等臟器觸片革蘭氏染色鏡檢，并將病料接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌；取24h 的肺臟增菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行純化培養(yǎng)；純化菌落劃線接種于血瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、HE 瓊脂平板，37℃24h 培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)；隨機(jī)挑選疑似目標(biāo)單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)24h，涂片革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 生化鑒定

參考《獸醫(yī)微生物》第四版4，腸桿菌科生化特性鑒定表，詳見下表2。將血清肉湯24h 培養(yǎng)物，按照杭州微生物試劑有限公司《腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管說明書》，接種于生化反應(yīng)管，觀察反應(yīng)結(jié)果。

表2 大腸桿菌生理生化指標(biāo)

1.2.5 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

取純化后營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書，提取細(xì)菌基因組作為PCR 反應(yīng)模板。

16 S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增：16S rRNA 條帶大小為194bp，PCR 擴(kuò)增體系為50μl：PCR 預(yù)混酶25μl，上下游引物各1μl，DNA 模板2μl，雙蒸水21μl。PCR 擴(kuò)增條件為：PCR 擴(kuò)增條件為，95℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30 個(gè) 循環(huán)；72℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

目的條帶的PCR 產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA5.1 軟件對(duì)16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用Kirby—Bauer 法。挑取單個(gè)菌落接種于MH 液體培養(yǎng)基中，37℃培樣16h，調(diào)整菌液濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.0 ×108CFU/ml）。用移液器移取200μL，用涂菌棒均勻涂布于M-H 瓊脂平板上，等培養(yǎng)基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)24h，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病死兔剖檢和瀕死期兔臨床觀察結(jié)果

對(duì)1 只已死亡兔進(jìn)行剖檢，可見胃膨大，充滿多量液體和氣體，腸壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指腸擴(kuò)張，腸道漿膜充血、出血、水腫，盲腸氣腫和黏膜充血、出血；肝臟腫大，有小點(diǎn)狀壞死灶，膽囊充盈；肺臟心臟、腎臟未見異常變化。對(duì)1 只瀕死期兔臨床觀察，可見病兔精神沉郁，伏臥不動(dòng)，身體消瘦、腹部脹氣狀；肛門周圍、后肢等部位皮毛被糞便沾濕，呈黃色，體溫升高到41.2℃；送檢第4 天死亡。

2.2 病料鏡檢和糞便蟲卵檢查結(jié)果

病料中均可檢出革蘭氏陰性直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對(duì)。

圖1 病料心臟革蘭氏染色

圖2 病料肺臟革蘭氏染色

圖3 病料肝臟革蘭氏染色

糞便經(jīng)飽和鹽水漂浮法檢測(cè)，在顯微鏡1 個(gè)視野下可見10～20 個(gè)大小不等和形態(tài)不一的球蟲蟲卵。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

病料組織24h 增菌培養(yǎng)物，分別腹腔接種4只小鼠，于接種后24h 內(nèi)死亡；對(duì)照組4 只小鼠72h 內(nèi)健活。由此說明分離株細(xì)菌毒力較強(qiáng)。

2.4 病原分離培養(yǎng)及菌落形態(tài)特征

死亡小鼠心臟、肝臟、肺臟，觸片革蘭氏染色鏡檢，見下圖Y。

圖4 鼠心臟觸片革蘭氏染色

圖5 鼠肝臟觸片革蘭氏染色

圖6 鼠肺臟觸片革蘭氏染色

純化細(xì)菌單菌落在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板菌落呈圓形隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色、半透明光澤的菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈帶金屬光澤的紫黑色菌落；HE 瓊脂平板上呈橘黃色菌落；血瓊脂平板上無溶血現(xiàn)象。詳見下圖X。

圖7 純化細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)特性

圖8 純化細(xì)菌伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)特性

圖9 純化細(xì)菌HE瓊脂培養(yǎng)特性

圖10 純化細(xì)菌血瓊脂培養(yǎng)特性

2.5 生化鑒定結(jié)果

表3 兔分離株大腸桿菌生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.6 16S rRNA 基因擴(kuò)增結(jié)果

圖11 分離株細(xì)菌16S rRNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.7 16S rRNA 基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

對(duì)分離菌株細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：分離株細(xì)菌的16S rRNA 基因序列在線Blast 分析顯示，其16S rRNA 基因序列與GenBank上已登錄(AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570) 的大腸桿菌的相應(yīng)序列具有高度同源性≥99.0%)；

根據(jù)16S rRNA 基因序列與上述同源性較高的大腸桿菌相應(yīng)序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖12可見，分離株與其同源較高的3 株菌形成了2 個(gè)獨(dú)立分支，且（AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570)3 株菌處在同一分支，而分離株單獨(dú)處一個(gè)大的分支。

圖12 分離株大腸桿菌16S rRNA 基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

2.8 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由上表可見，分離株大腸桿菌對(duì)丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、頭孢他啶、多粘菌素B高度敏感；對(duì)氧氟沙星、新霉素、頭孢哌酮、紅霉素中度敏感；對(duì)青霉素、諾氟沙星、萬古霉素、卡那霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、頭孢拉定、哌拉西林具有耐藥性。結(jié)果詳見下表

3 討論

通過送檢單信息和電話聯(lián)系獲知，該長(zhǎng)毛兔養(yǎng)殖場(chǎng)存欄1250 只，發(fā)病166 只，死亡67 只，發(fā)病率為13.28%，病死率為40.36%。最初發(fā)病時(shí)間在2018年9月28日，發(fā)病兔日齡在4月齡左右。在此期間，采用頭孢氨芐注射液、復(fù)方磺胺甲噁唑、甲砜霉素VB 治療，治療效果一般。由上述發(fā)病情況、治療情況，以及送檢臨床癥狀和病死兔剖檢情況，初步判斷該養(yǎng)殖場(chǎng)兔死亡的原因?yàn)橐伤仆们蛳x病和大腸桿菌病混合感染導(dǎo)致的死亡。

經(jīng)試驗(yàn)分析，根據(jù)兔糞便蟲卵檢查和分離的細(xì)菌在普通培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)、顏色、大小等和染色顯微鏡觀察結(jié)果，并結(jié)合細(xì)菌生化試驗(yàn)和16S rRNA 測(cè)序結(jié)果表明，證實(shí)該其疫情是由兔球蟲和大腸桿菌混合感染引起。試驗(yàn)中對(duì)分離株細(xì)菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)表明：該分離株細(xì)菌對(duì)丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、頭孢他啶、多粘菌素B 高度敏感；對(duì)氧氟沙星、新霉素、頭孢哌酮、紅霉素中度敏感；對(duì)青霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、卡那霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、羧芐西林、頭孢氨芐、麥迪霉素、氯霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、頭孢拉定、哌拉西林具有耐藥性。由此可鑒，養(yǎng)殖戶治療期間，所使用的抗生素頭孢氨芐注射液、復(fù)方磺胺甲噁唑都對(duì)此菌具有很強(qiáng)的耐藥性，所以導(dǎo)致治療效果一般。因此，在臨床應(yīng)用上，防治兔球蟲病和大腸桿菌病混合感染的病例，應(yīng)將抗球蟲藥物配和藥敏試驗(yàn)敏感性藥物，交替輪換使用，避免產(chǎn)生耐藥性。

后期經(jīng)反饋該兔專業(yè)養(yǎng)殖，社針對(duì)抗球蟲，配合抗生素治療，其治療效果極佳，暫無發(fā)病死亡兔。因此，對(duì)于兔球蟲和大腸桿菌病，應(yīng)遵從預(yù)防為主，防治結(jié)合的原則，根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)確定治療方案，避免濫用抗生素導(dǎo)致生產(chǎn)耐藥性并影響食品安全。防控方面[6]：必須加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,避免擁擠、受寒、受熱，提高抵抗力；嚴(yán)把飼草料和飲用水質(zhì)量關(guān)；搞好兔舍及周圍環(huán)境衛(wèi)生，及時(shí)清理糞便及其他污染物，保持兔舍的清潔、通風(fēng)、干燥，并嚴(yán)格執(zhí)行定期消毒制度，對(duì)兔舍、用具等進(jìn)行全面消毒，并注意交替使用消毒藥。

表4 分離株兔大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表