羅丹　張俊　趙文波　林洪春　楊婕綸　李詠倢　彭暉

【摘要】 目的探討血液透析和腹膜透析對終末期腎臟?。?ESRD）患者腸道菌群的影響。方法選擇健康對照者19名（健康對照組）、未透析的ESRD患者38例（未透析組）、持續(xù)腹膜透析的ESRD患者25例（PD組）、持續(xù)血液透析的ESRD患者27例（HD組），使用16S rDNA測序分析研究對象的糞便樣品中腸道微生物群的組成和功能。結(jié)果與健康對照組比較，未透析的ESRD患者α多樣性中的Simpson指數(shù)升高（P<0.05），未透析組、PD組、HD患者腸道菌群的α多樣性O(shè)bserved species指數(shù)、Chaol指數(shù)和Simpson指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。B多樣性分析顯示4組之間物種組成結(jié)構(gòu)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。健康對照組及未透析組腸道菌群以擬桿菌門和厚壁菌門為主。與未透析組相比，HD組腸道菌群擬桿菌門減少（P<0.01）。4組研究對象的腸道菌群在科水平分類中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義的菌科有8個（P均<0.05），其中PD組和HD組腸道中普雷沃特爾菌科比例均較低。與未透析組比較.HD組腸道中毛螺菌科比例增加、脫硫弧菌科和紫單胞菌科比例降低;HD組腸道中理研菌科減少（P均< 0.05）。與健康對照組相比，未透析組腸道中紫單胞菌科比例增加（P<0.05）。丹毒絲菌科比例在未透析組、PD組、HD組腸道中均有所增加，產(chǎn)堿菌科和韋榮氏菌科比例在健康對照組、未透析組、PD組腸道中相近，但在HD組腸道中降低（P均<0.05）。結(jié)論血液透析和腹膜透析治療未明顯破壞腸道菌群的多樣性，但改變了ESRD患者腸道菌群的種類和數(shù)量。

【關(guān)鍵詞】 腸道菌群;終末期腎臟病;透析;16S r脫氧核糖核酸測序

人類的腸道中含有超過100萬億個微生物，它們影響著宿主的營養(yǎng)、代謝、生理和免疫功能[1]。腸道微生物包括細(xì)菌、真菌、古生菌、原生動物和病毒等，主要以細(xì)菌為主[2]。多項研究表明，慢性腎臟?。?CKD）患者腸道菌群的種類和數(shù)量都較健康人群發(fā)生了變化，導(dǎo)致致病菌的增多或腸道代謝產(chǎn)物的蓄積，這些都會進(jìn)一步影響疾病的進(jìn)程和預(yù)后[3-4]。當(dāng)CKD發(fā)展到終末期腎臟?。‥SRD）時，最常見的治療為血液透析和腹膜透析，因血液透析的患者會以動靜脈瘺/移植物或靜脈導(dǎo)管的形式存在血管通路以及嚴(yán)格的飲食限制，而腹膜透析存在長期的腹膜導(dǎo)管和不斷流人的含有微生物營養(yǎng)素的腹膜透析液，這些都可能進(jìn)一步影響人類腸道菌群的組成及功能[5]。目前關(guān)于血液透析及腹膜透析對腸道菌群影響的研究較少，相關(guān)研究主要集中于將ESRD患者或替代治療的患者腸道菌群與健康對照者比較，沒有與未接受血液透析或腹膜透析治療的ESRD患者相比，因為腸道菌群的改變可能是替代治療或CKD本身（或兩者兼有）的結(jié)果。針對這一問題，進(jìn)一步確認(rèn)血液透析和腹膜透析對ESRD患者腸道菌群的影響十分必要。為此，本研究選擇了健康志愿者、未透析的ESRD患者和行腹膜透析或血液透析的ESRD患者，使用16S rDNA測序分析其糞便樣品中腸道微生物群的組成和功能，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

一、研究對象

選擇2018年8月至2019年2月就診于我院的健康體檢者或ESRD患者。ESRD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：利用CKD流行病學(xué)公式計算腎小球濾過率，腎小球濾過率<15 ml/（ min.1.73 m2）。排除標(biāo)準(zhǔn)：腹瀉者，不能自行進(jìn)食或使用腸內(nèi)、外營養(yǎng)干預(yù)者，胃腸道腫瘤、膽道炎癥、炎癥性腸病等消化道疾病者，近3個月有局部炎癥、全身性感染者，近3個月服用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、益生菌等藥物者。共納入109例研究對象，分為4組：腎功能正常的健康志愿者19名（健康對照組）、未透析的ESRD患者38例（未透析組）、持續(xù)規(guī)律腹膜透析6個月以上的ESRD患者25例（PD組）、持續(xù)規(guī)律血液透析6個月以上的ESRD患者27例（HD組）。本研究操作程序遵循中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有操作均征得研究對象或其親屬的知情同意。

二、研究方法

1.樣品采集

用無菌棉簽取中段成型大便放入無菌大便盒，做好標(biāo)記，迅速放入超低溫冰箱中儲存。

2.腸道菌群的檢測

采用16S rDNA測序分析，通過糞便DNA基因組提取試劑盒（美國Qiagen）提取糞便樣品中的DNA，特異性擴增樣品中的微生物16S rDNA的高變區(qū)，采用高通量測序平臺Hiseq或Miseq對高變區(qū)序列進(jìn)行測序，然后通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析和物種注釋，了解樣品的群落組成情況。

3.數(shù)據(jù)分析

使用Illumina Hiseq或Miseq測序平臺獲得的原始測序序列，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切過濾，獲得有效數(shù)據(jù);通過測序序列之間的重疊關(guān)系將序列貼上標(biāo)簽，在給定的相似度下將標(biāo)簽聚類成可操作分類單元（ OTU），選取OTU的代表性序列，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得物種注釋，從而得到每個樣品的群落組成信息。腸道菌群的多樣性可用α多樣性和β多樣性進(jìn)行分析，α多樣性中的Observed species指數(shù)和Chaol指數(shù)反映樣品中群落的豐度，即僅考慮群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況。α多樣性中的Simpson指數(shù)同時考慮了物種組成的豐度和均勻度2個因素，Simpson指數(shù)越高表示腸道菌群分布越不均勻[6]?；贠TU代表序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合物種豐度信息，通過主坐標(biāo)分析（ PCoA），進(jìn)一步比較不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異。通過LDA分析（線性回歸分析）在各組之間進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)中有顯著作用的微生物類群獲得LDA分值（篩選條件LDA分值>2.0，P<0.05），展現(xiàn)組中豐度有顯著差異的菌。B多樣性用Unifrac距離矩陣比較生物的多樣性。Unifrac距離矩陣分為Weighted（加權(quán)）和Unweighted（非加權(quán)）2種方法，對不同樣品間的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較。其中加權(quán)計算方法僅考慮物種有無的變化，對稀有物種比較敏感，加權(quán)計算方法同時考慮物種有無和物種豐度的變化，對豐度較高的物種更加敏感。同時記錄距患者采集大便標(biāo)本當(dāng)日最近1次的實驗室相關(guān)檢查數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

通過LEfSe對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，區(qū)別2個或2個以上生物條件（或者是類群）。該算法強調(diào)的是統(tǒng)計意義和生物相關(guān)性。使用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較Kruskal-Wallis檢驗;計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用Z2檢驗?？傮w比較P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，非正態(tài)分布的計量資料4組間兩兩比較用Bonferroni法校正檢驗水準(zhǔn)，P<0.05/6= 0.008為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、健康對照組、未透析組、PD組、HD組的臨床資料比較

健康對照組、未透析組、PD組、HD組的性別、年齡、BMI、血脂比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），4組的血尿素氮、血肌酐、腎小球濾過率、血紅蛋白、血清白蛋白、血鉀、血鈣、血磷比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）。未透析組、PD組、HD組的糖尿病、高血壓病患者比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），PD組與HD組的透析時間及透析充分性比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見表1。

二、腸道菌群多樣性的改變

健康對照組、未透析組、PD組、HD組的Observed species指數(shù)和Chaol指數(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。與健康對照組比較，未透析組ESRD患者α多樣性中的Simpson指數(shù)升高（P<0.008），HD組與PD組間Simpson指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.008），見表2。Unifrac距離矩陣圖非加權(quán)結(jié)果中未透析組、PD組、HD組部分患者與健康對照組空間距離較遠(yuǎn)，提示組間物種組成結(jié)構(gòu)有差異，但各組之間未見明顯分群。未透析組、PD組、HD組患者腸道菌群組內(nèi)樣本較分散，而健康者的樣本較集中（圖1A），提示患者腸道菌群個體差異較大?；诜羌訖?quán)的PCI主成分和PC2主成分對4組研究對象進(jìn)行分析，0表示兩個微生物群落間OTU的種類一致，采用Bonferroni法校正檢驗水準(zhǔn)后，各組間PCI主成分和PC2主成分兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.008），見圖1B、C。加權(quán)結(jié)果中，4組研究對象的菌群均較為分散（圖1D），0則表示群落間OTU的種類和數(shù)量均一致，基于加權(quán)的PC1主成分分析顯示HD組的多樣性與ESRD組和PD患者均不同（P均< 0.008），在PC2主成分方面，4組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1E、F。

三、各組之間腸道菌群組成的差異性分析

腸道菌群按照門、綱、目、科、屬進(jìn)行分類，與健康對照組比較，未透析組中居前3位的優(yōu)勢菌種為紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、副桿菌屬（Parabacteroides）、顫螺旋菌屬（Oscillo.spira）;PD組中居前3位的優(yōu)勢菌種為紫單胞菌科、副桿菌屬、布勞特菌屬（Blautia）;HD組中居前3位的優(yōu)勢菌種為瘤胃球菌屬（ Ruminococcus）、布勞特菌屬、糞球菌屬（ Coprococcu.s）。4組患者的腸道中均以擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為主（圖2A）。在相對豐度排名前6位的菌門中，與未透析組相比，HD患者腸道中的擬桿菌門比例減少（圖2B），其余5個菌門如放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）組間分布均近似。在科水平上，有8個菌科在各組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），無論是與對照組還是未透析組比較，PD組和HD組患者腸道菌群中的普雷沃特爾科（Prevotellaceae）均減少（圖3A）。與未透析組比較，HD組毛螺菌科（Lachnospiraceae）比例較高、紫單胞菌科和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）比例較低，PD組理研菌科（Rikenellaceae）比例較低（圖3B -D、H）。與健康對照組比較，未透析組紫單胞菌科比例較高，未透析組、PD組、HD組丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）比例均較高（圖3B、E）。產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae）和韋榮菌科（ Veillonellaceae）在健康對照組、未透析組、PD組中所占的比例相似（P均> 0.05），但在HD組中下降（圖3F、G）。

討 論

在我國，CKD的發(fā)生率逐年上升，多種因素如高血磷、高甲狀腺旁腺素和尿蛋白升高等均可以導(dǎo)致腎功能減退[7]。盡管可以利用血液透析或腹膜透析幫助緩解患者的癥狀，但ESRD患者仍會出現(xiàn)各種并發(fā)癥，病死率較高。WHO預(yù)測，至2030年，每10萬人中有14人因CKD死亡，病死率將持續(xù)增加[8]。CKD患者除了需要長期接受藥物治療，如抗生素、糖皮質(zhì)激素或免疫抑制藥、鈣磷調(diào)節(jié)藥物等，還需嚴(yán)格控制飲食，如避免食用富含鈉、鉀和磷酸鹽的食物等，這些均可影響腸道菌群的定植及生長，易導(dǎo)致心血管疾病、感染、貧血、內(nèi)環(huán)境代謝紊亂等的發(fā)生、發(fā)展[9]。正常情況下，腸黏膜屏障可阻止有害微生物或毒性代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，腸道菌群能夠維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腸道菌群失調(diào)時，產(chǎn)生多種毒素，并通過受損的腸黏膜上皮進(jìn)入血循環(huán)。

本研究顯示，未透析組的腸道菌群α多樣性較健康對照組下降，但HD組和PD組的α多樣性與未透析組相似。β多樣性未見明顯分群，但主成分統(tǒng)計分析顯示各組間存在差異，未透析組、PD組、HD組的組內(nèi)差異較大，提示透析可影響ESRD腸道菌群多樣性，但未造成嚴(yán)重破壞。Crespo-Salgado等[10]對接受腹膜透析或血液透析治療的美國中西部兒童和年齡匹配健康兒童的腸道微生物群進(jìn)行比較，采用腹膜透析Whole tree和Chaol指數(shù)評價，結(jié)果顯示血液透析患兒腸道菌群與健康兒童相似，腹膜透析患兒的α多樣性顯著下降。另有研究對中國南方的ESRD患者和健康對照者進(jìn)行腸道菌群測序分析，結(jié)果顯示兩者的α多樣性和β多樣性相似[11]。由此推測，研究結(jié)果不一樣可能是受年齡、種族、地域、基礎(chǔ)病因等多種因素的影響。

本研究還顯示，未透析組腸道中普雷沃特爾科減少，但在PD組和HD組中減少更明顯。HD組腸道中毛螺菌科所占的比例比未透析組明顯增加。普雷沃特爾科和韋榮氏菌科均可產(chǎn)生短鏈脂肪酸[12]。擬桿菌門主要產(chǎn)生琥珀酸鹽和乙酸鹽[13]。短鏈脂肪酸包括丙酸鹽，乙酸鹽和丁酸鹽，具有維持腸道屏障功能和抗炎作用[14]。腹膜透析和血液透析造成產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群減少，易導(dǎo)致腸道屏障的破壞和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究表明，CKD患者發(fā)生心腦血管疾病的風(fēng)險與毛螺菌科過度生長及普雷沃特爾科的減少有關(guān)[3]。上述研究結(jié)果均提示，透析患者易發(fā)生心腦血管疾病的原因可能與某些腸道菌群的數(shù)量變化有關(guān)。普雷沃菌屬（Prevotella）的下降影響糞便的形成及排空[15]。腸道菌群紊亂易導(dǎo)致便秘，代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)經(jīng)腸道上皮吸收增加，促進(jìn)尿毒癥毒素的累積。丹毒絲菌科與結(jié)腸癌和胃腸道炎癥性疾病相關(guān)，還與代謝性疾病相關(guān)，在肥胖或高膽固醇血癥人群腸道中具有更高比例的丹毒絲菌科[16]。上述研究均提示，ESRD和透析治療會導(dǎo)致腸道中某些潛在致病菌的增多，疾病發(fā)生風(fēng)險增加。

脫硫弧菌科是變形桿菌的一個亞目，是一種硫酸鹽還原微生物，可利用硫酸鹽進(jìn)行無氧呼吸，將其還原為硫化氫，一定量的硫化氫對腸黏膜具有保護(hù)性作用[17]。然而，高濃度的硫化氫對結(jié)腸收縮性有抑制作用[18-19]的比例多于健康對照組。與未透析組相比，HD組脫硫弧菌科減少，與健康對照組相近。此外，在4組研究對象中僅HD組腸道中產(chǎn)堿菌科減少，有報道指，腸道中脫硫弧菌科和產(chǎn)堿菌科可以產(chǎn)生脲酶[11]。脲酶分解尿素所產(chǎn)生的氨，會導(dǎo)致腸道上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能的大量破壞，使得腸道源性尿毒癥毒素、內(nèi)毒素、抗原和腸道微生物或其他微生物產(chǎn)物進(jìn)入循環(huán)[15]。有報道紫單胞菌科的富集與腺瘤和癌有關(guān)[20]。本研究中，未透析組中腸道中紫單胞菌科增多，而HD組腸道中紫單胞菌科減少。由此推測，血液透析在一定程度上可以改善機體的內(nèi)環(huán)境紊亂，幫助恢復(fù)腸道菌群的平衡。

Stadlbauer等[21]研究了3例ESRD患者（15例血液透析，15例腹膜透析）的糞便微生物組成和功能，并與21名健康對照者進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，與健康對照者相比，血液透析患者的潛在致病菌增加、有益菌減少，腹膜透析患者的有益菌減少程度較小，并提出了腸道菌群的變化與患者炎癥相關(guān)，而與腸道通透性無關(guān)，腎臟替代治療是ESRD中生態(tài)失調(diào)的重要因素。多項研究已經(jīng)報道過ESRD患者存在腸道菌群失衡，本研究增加了研究對象的樣本量，并進(jìn)行腹膜透析和血液透析患者與未透析的ESRD患者腸道菌群構(gòu)成的比較，排除了ESRD本身對腸道菌群的影響，進(jìn)一步明確了透析對ESRD患者的影響，以及血液透析和腹膜透析對腸道菌群改變的不同之處，有助闡明透析造成ESRD患者微量元素及其他臨床相關(guān)指標(biāo)改變的原因，為改善ESRD患者的生活質(zhì)量提供策略。

本研究有一定的局限性。本研究是單中心橫斷面研究，樣本量較小，可能存在選擇偏倚。相對于其他物種來說，人類個體間差異較大，易受飲食和藥物等多種因素的影響[22]。日后我們將繼續(xù)追蹤未透析的ESRD患者接受透析治療后腸道菌群的變化，避免個體差異帶來的影響。

綜上所述，無論是血液透析還是腹膜透析均改變了ESRD患者的腸道菌群組成，ESRD患者腸道菌群的多樣性受到了影響，但沒有遭到嚴(yán)重破壞。透析治療在某些程度上增加了一些潛在致病菌，易誘發(fā)感染、心血管疾病等并發(fā)癥，但也能通過透析幫助清除體內(nèi)毒素，抑制致病菌的生長繁殖和促進(jìn)有益菌的積累，從而緩解腸道菌群的紊亂。腸道微生物群的改變與透析治療腎臟疾病是一個相互作用的過程，維持透析患者腸道微生態(tài)平衡具有重要作用。

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