曲 杰，林萍萍，呂喜英，吳練練，李青山*

(1.河北承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腫瘤科，河北 承德 067000；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，武漢 430060)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。NOP56 核糖核蛋白(NOP56 ribonucleoprotein, NOP56)是一種核仁蛋白，是C/D盒小核仁核糖核酸復(fù)合物(snoRNPs)的重要組成部分，在60S核糖體亞基組裝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，涉及rRNA前體的早中期加工[2](MIM#614154)。研究報(bào)道，NOP56表達(dá)受原癌基因c-Myc調(diào)控[3]，同時(shí)，NOP56也可調(diào)節(jié)c-Myc從而促進(jìn)Burkitt淋巴瘤生長[4]。NOP56可以與hPygo2蛋白結(jié)合，促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞生長[5]。在人乳腺癌細(xì)胞中，NOP56基因敲除后細(xì)胞集落形成能力和生長能力明顯降低[6]。然而，NOP56在人乳腺癌組織中的表達(dá)情況及臨床意義的大數(shù)據(jù)分析尚未見報(bào)道。

通過對美國生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)[7]和美國國立健康中心(The National Institude of Health,NIH)的癌癥基因圖集數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)[8]公共數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,探索NOP56在人乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床病理關(guān)系，同時(shí)在K-M plotter 在線數(shù)據(jù)庫中研究NOP56的預(yù)后價(jià)值。進(jìn)一步利用String、GSEA數(shù)據(jù)庫，挖掘乳腺癌中與NOP56存在互相作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)，篩選與NOP56存在相互作用的基因并建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，WebGestalt數(shù)據(jù)庫尋找靶向藥物[9]，為乳腺癌的分子機(jī)制研究提供新的切入點(diǎn)和同時(shí)進(jìn)一步探討臨床靶向藥物治療的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載原始數(shù)據(jù)，通過MAS5進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，乳腺癌組織登錄號為GSE42568、GSE15852、GSE10780和GSE45255。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載原始數(shù)據(jù)，通過RSEM標(biāo)準(zhǔn)化。納入的數(shù)據(jù)基本信息見表1。

表1 納入的4套乳腺癌基因芯片基本信息Table 1 Basic information of four GEO datasets of breast cancer

1.2 差異表達(dá)基因分析

在數(shù)據(jù)集GSE15852中，通過配對樣本T檢驗(yàn)比較乳腺癌和配對癌旁組織NOP56表達(dá)差異。在數(shù)據(jù)集GSE42568和GSE10780中，通過非配對樣本T檢驗(yàn)比較乳腺癌和正常組織NOP56表達(dá)差異；在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過非配對樣本T檢驗(yàn)比較不同臨床病理分期的乳腺癌和配對癌旁組織NOP56表達(dá)差異；在TCGA數(shù)據(jù)庫中，通過非配對樣本T檢驗(yàn)比較不同臨床病理分期乳腺癌組織和配對癌旁組織NOP56表達(dá)差異。

1.3 數(shù)據(jù)集篩選與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性研究

TCGA數(shù)據(jù)集和GSE45255基因樣本量大且附帶臨床信息，利用此數(shù)據(jù)集進(jìn)行進(jìn)一步的相關(guān)性研究。其中臨床資料缺失的樣本被排除，根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對樣本的NOP56表達(dá)進(jìn)行由高到低排序,高于信號log2中位數(shù)的樣本作為高表達(dá)組，低于信號log2中位數(shù)的樣本作為低表達(dá)組。

1.4 Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫分析

利用在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier plotter (http://www. kmplot.com/breast) 獲得的3 951例乳腺癌患者信息，以NOP56表達(dá)中位值(Median) 將樣本分為低表達(dá)和高表達(dá)組，利用缺省設(shè)置，在線分析NOP56對乳腺癌患者總生存期和無病生存期的預(yù)后價(jià)值。

1.5 NOP56互相作用基因篩選和功能富集分析

利用String(https://string-db.org)在線數(shù)據(jù)庫篩選人乳腺癌樣本中與NOP56存在互作關(guān)系的蛋白質(zhì)并且獲得互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。通過R3.5軟件計(jì)算互作基因在分子功能、生物過程、細(xì)胞組分以及三者平均的語義相似性并繪制熱圖。利用GSEA3.0軟件對上述互作基因進(jìn)行富集分析。

1.6 靶向藥物富集分析

利用WebGestalt(http://www.webgestalt.org)在線數(shù)據(jù)庫富集分析互作基因的靶向藥物。

1.7 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗(yàn)法。臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher 確切概率法。以P< 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。篩選共表達(dá)基因采用spearman和Pearson檢驗(yàn)，spearman分?jǐn)?shù)和 Pearson分?jǐn)?shù)均大于0.3的基因被認(rèn)為有共表達(dá)關(guān)系。功能分析采用Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05的功能集合被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 NOP56在人乳腺癌組織中高表達(dá)

在GEO數(shù)據(jù)庫的3個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE42568、GSE15852和GSE10780中，與正常組織相比，NOP56在人乳腺癌組織中顯著高表達(dá)。在TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集中，1 093例乳腺癌組織與112例正常組織相比，NOP56在人乳腺癌組織中顯著高表達(dá)(見圖1)；不同臨床病理分期的乳腺癌組織與正常組織相比，NOP56均高表達(dá)(P< 0.001)(見表2)。

圖1 NOP56在人乳腺癌組織中高表達(dá)Fig.1 Overexpressed NOP56 in human breast cancer

數(shù)據(jù)來源分期P值TCGAStage I<0.001Stage II<0.001Stage III<0.001Stage IV<0.001

2.2 NOP56高表達(dá)與患者不良臨床病理參數(shù)相關(guān)

2.2.1 分析GSE45255 數(shù)據(jù)集中年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)狀態(tài)、孕激素受體

(PRG)狀態(tài)、人表皮生長因子受體2(HER2)狀態(tài)、組織學(xué)分級和腫瘤大小等臨床病理參數(shù)與NOP56表達(dá)高低的相關(guān)性。結(jié)果顯示，NOP56 高表

達(dá)在組織學(xué)分級為G3的腫瘤樣本中更常見，而在分化程度較高的G1、G2腫瘤樣本中，NOP56低表達(dá)更多見(P< 0.001)，提示NOP56高表達(dá)與乳腺癌的進(jìn)展呈正相關(guān)。同時(shí)，NOP56與乳腺癌HER2狀態(tài)相關(guān)，在HER2狀態(tài)陽性的患者中高表達(dá)(P=0.019) 。NOP56的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PRG狀態(tài)、ER狀態(tài)和腫瘤大小無顯著相關(guān)性(見表3)。

2.2.2 分析TCGA 數(shù)據(jù)集中年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)狀態(tài)、孕激素受體

(PRG)狀態(tài)、人表皮生長因子受體2(HER2)狀態(tài)和病理分期等臨床病理參數(shù)與NOP56表達(dá)高低的相關(guān)性。結(jié)果顯示， NOP56與乳腺癌HER2狀態(tài)、年齡、PRG狀態(tài)相關(guān)，在HER2狀態(tài)陽性的患者中高表達(dá)( P=0.019) ，在年齡< 55歲的患者中高表達(dá)(P<0.001)，在PRG陰性的患者中高表達(dá)(P<0.000 1)。NOP56的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和ER狀態(tài)無顯著相關(guān)性(見表4)。GEO數(shù)據(jù)庫與TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。

2.3 NOP56高表達(dá)提示不良預(yù)后

K-M plotter生存分析顯示，NOP56高表達(dá)患者的無進(jìn)展存活期(Disease free survival，DFS)和總存活期(Overall survival，OS)均明顯較低表達(dá)患者短(P< 0.001，見圖2)。這表明NOP56低表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)，NOP56可能成為預(yù)測乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)(見圖2)。

表3 不同NOP56表達(dá)與GEO數(shù)據(jù)庫139例乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 3 Correlation between NOP56 expression and clinicopathological parameters in 139 patients with breast cancer

表4 不同NOP56表達(dá)與數(shù)據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫庫1 093例乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 4 Correlation between NOP56 expression and clinicopathological parameters in 1 093 patients with breast cancer in TCGA

圖2 NOP56表達(dá)水平與乳腺癌患者生存時(shí)間關(guān)系Fig.2 Correlation between NOP56 expression and the prognosis of breast cancer patients

2.4 NOP56互作及其功能

String在線數(shù)據(jù)庫篩選人乳腺癌樣本中與 NOP56存在互作關(guān)系較強(qiáng)的基因10個(gè)。(見圖3(a)) R3.5進(jìn)行語義相似性分析(見圖3(b)、(c)、(d)、(e))

圖3 NOP56蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及共表達(dá)基因與NOP56分子功能、生物過程、細(xì)胞組分以及平均語義相似性Fig.3 Gene interaction network diagram of NOP56 and the molecular function，biological process,cellular component，and the mean semantic similarity between NOP56 and its co-expressed genes

利用GSEA數(shù)據(jù)庫對互作基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示這些基因主要富集在RNA加工，細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制等與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的功能上(見圖4)。

圖4 NOP56共表達(dá)基因主要富集在RNA加工和細(xì)胞分裂等與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的功能上Fig.4 NOP56 co-expression genes are mainly enriched in the functions closely related to the tumor development such as RNA processing and cell division

2.5 NOP56互作基因靶向藥物

WebGestalt網(wǎng)站分析顯示，以上互作基因靶向藥物有5種，其中互作基因作為靶基因最多的為放線菌素D(見表5)

表5 靶向基因藥物Table 5 Targeted gene drugs

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展離不開異常的蛋白質(zhì)生物合成[6]，而細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成需求與核糖體生物合成活性相協(xié)調(diào)，當(dāng)某些關(guān)鍵的核糖體蛋白水平上調(diào)后，可通過調(diào)節(jié)其他蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞生長代謝[10]。研究表明，核糖體生物合成速率增加促進(jìn)原癌基因Myc表達(dá)，增加癌細(xì)胞增殖能力[8]，同時(shí)可通過釋放MDM2蛋白降解抑癌基因p53[12]和pRb[13]，增加癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)。核糖體生物合成活躍可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力，增加乳腺癌惡性程度[14]。NOP56是小分子核仁核糖核蛋白(snoRNP)復(fù)合體的核心蛋白質(zhì)成員，直接對rRNA前體核糖部分進(jìn)行甲基化修飾，在核糖體生物合成中發(fā)揮重要作用[15]。NOP56突變可導(dǎo)致60S核糖體亞基裝配缺陷，rRNA加工受抑[15]。研究表明，NOP56可調(diào)節(jié)原癌基因c-Myc促進(jìn)Burkitt淋巴瘤細(xì)胞生長[4]，同時(shí)可以與hPygo2蛋白結(jié)合，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長[5]。本研究通過生物信息學(xué)分析，首次在人乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)NOP56顯著高表達(dá)，且NOP56高表達(dá)與乳腺癌不良臨床病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)。為進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，我們探索了乳腺癌中NOP56共表達(dá)基因、互作蛋白及其功能，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫，我們首次發(fā)現(xiàn)NOP56在人乳腺癌中顯著高表達(dá)。在GSE45255中，數(shù)據(jù)顯示NOP56高表達(dá)患者乳腺癌分化程度低。這與已有的研究一致，Su H等人發(fā)現(xiàn)NOP56促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞集落形成能力和生長能力[6]。此外，我們發(fā)現(xiàn)NOP56在HER2陽性患者中高表達(dá)。HER2過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。HER2基因編碼酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白，與相應(yīng)配體結(jié)合導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化，引起細(xì)胞生長、增殖相關(guān)信號通路如NF-κB等的連鎖反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化[17]。HER2陽性乳腺癌細(xì)胞c-Myc表達(dá)水平高，敲低HER2基因后c-Myc表達(dá)降低[18]，而c-Myc可直接促進(jìn)NOP56表達(dá)[3]。這說明乳腺癌中HER2可能通過激活細(xì)胞生長增殖相關(guān)信號通路上調(diào)c-Myc等原癌基因從而促進(jìn)NOP56表達(dá)。我們進(jìn)一步利用在線數(shù)據(jù)庫K-M plotter，對3 951例乳腺癌患者進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)NOP56高表達(dá)乳腺癌患者生存期顯著降低。乳腺癌組織中NOP56表達(dá)水平，或許可以作為乳腺癌患者新的檢測指標(biāo)和遠(yuǎn)期預(yù)后評價(jià)指標(biāo)，但還需大樣本的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

為了進(jìn)一步理解乳腺癌中NOP56異常表達(dá)的機(jī)制，篩選出NOP56最顯著的互作基因10個(gè)。單一的基因異常往往伴隨下游基因的連鎖異常反應(yīng)，這是多種癌癥相關(guān)基因異常促進(jìn)癌癥發(fā)展的重要原因之一。功能分析顯示，NOP56共表達(dá)基因主要參與RNA加工，細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制等與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的功能。這些結(jié)果與現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Victoria H.等[5]發(fā)現(xiàn)NOP56 基因過表達(dá)后，Burkitt淋巴瘤細(xì)胞的增殖明顯加快；Yuichi J.等[19]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌上皮細(xì)胞中Nop56促進(jìn)細(xì)胞周期G1期縮短，是細(xì)胞周期進(jìn)程的重要介質(zhì)。研究證明NOP56共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的準(zhǔn)確性，提示NOP56可能通過影響這些共表達(dá)基因來發(fā)揮其促癌作用。

最后，我們篩選出了NOP56互作基因富集的靶向藥物，選取了富集基因最多的放線菌素類中的放線菌素D。放線菌素D(更生霉素)是第一種顯示出具有抗腫瘤活性的抗生素，是臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，現(xiàn)在常用于各種小兒腫瘤，如腎母細(xì)胞瘤，橫紋肌肉瘤和尤因氏肉瘤的治療[20-22]。放線菌素D是一種DNA嵌入劑，它更偏向于富含GC的DNA序列[ 23 ]。Perry RP等人發(fā)現(xiàn)低濃度的放線菌素D可以破壞核糖體正常的生物過程，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[ 23-25]。Das T等人研究發(fā)現(xiàn)放線菌素D可以下調(diào)SOX2表達(dá)，從而誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞死亡[26]。通過這些研究我們可以假設(shè)，放線菌素D通過靶向作用于NOP56以及其互作基因達(dá)到對乳腺癌的治療作用，放線菌素D的治療作用可能與NOP56的表達(dá)量相關(guān)，而這些假設(shè)還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以及臨床驗(yàn)證。

綜上所述，利用公共數(shù)據(jù)庫證明乳腺癌組織中NOP56高表達(dá)，NOP56促進(jìn)腫瘤分化，在HER陽性患者中表達(dá)量高，且與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。機(jī)制上，我們研究了乳腺癌中NOP56共表達(dá)基因，其功能主要為RNA加工，細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制等與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的功能，并構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)互作基因靶向藥物明顯富集在放線菌素D上。系統(tǒng)地研究了NOP56在乳腺癌中的表達(dá)與臨床預(yù)后、臨床病理狀態(tài)以及組織學(xué)分級的關(guān)系，探討了分子機(jī)制以及與臨床靶向藥物的關(guān)系，為乳腺癌防治提供潛在的新的預(yù)測指標(biāo)，完善了臨床靶向藥物使用的分子機(jī)制。