李小軍，徐 鑫，張自陽，劉明久，茹振鋼

(1.河南科技學(xué)院，河南省現(xiàn)代生物育種協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

分子標(biāo)記技術(shù)大大推動(dòng)了作物育種和基因組研究的發(fā)展，其中，因SSR具有易操作、重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富及共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于小麥、水稻和玉米等植物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位及標(biāo)記輔助選擇等研究[1-2]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，新近開發(fā)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記具有密度高、代表性強(qiáng)和遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，目前，小麥上已開發(fā)出以SNP標(biāo)記為基礎(chǔ)的Illumina iSelect9k、Illumina iSelect90k、Affymetrix Axiom660k和Affymetrix Axiom55k等芯片[3]，并逐步應(yīng)用于小麥遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和關(guān)聯(lián)分析等方面的研究[4-6]。但SNP芯片價(jià)格昂貴是進(jìn)行大規(guī)模群體檢測(cè)的主要限制因素，相比之下SSR標(biāo)記仍是多數(shù)學(xué)者進(jìn)行遺傳研究選用的重要標(biāo)記類型。迄今，雖然普通小麥上已開發(fā)了大量SSR標(biāo)記，但由于其基因組龐大且復(fù)雜(基因組大小達(dá)到了16×109bp，其中超過80%為重復(fù)DNA)，現(xiàn)有的SSR標(biāo)記密度仍很低，難以滿足當(dāng)前高通量基因組的研究需要。因此，開發(fā)新的SSR標(biāo)記對(duì)于小麥遺傳研究具有重要意義。

SSR標(biāo)記是根據(jù)每個(gè)SSR重復(fù)序列的兩端保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)分析不同樣品間重復(fù)序列的長度多態(tài)性。早期SSR標(biāo)記的開發(fā)主要是在構(gòu)建基因組文庫、篩選SSR克隆并測(cè)序的基礎(chǔ)上根據(jù)DNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。例如，Guyomarc′h等[7]根據(jù)節(jié)節(jié)麥的SSR克隆序列成功開發(fā)了270個(gè)能在普通小麥中有效擴(kuò)增的SSR引物。R?der等[8]根據(jù)中國春小麥基因組文庫中720個(gè)SSR克隆序列設(shè)計(jì)引物，在294個(gè)能擴(kuò)增出預(yù)期大小DNA片段的引物中，約80%在2個(gè)小麥品種Opata85和W7984間表現(xiàn)多態(tài)，并構(gòu)建了第一張高密度微衛(wèi)星標(biāo)記小麥遺傳圖譜。Li等[1]開發(fā)了856個(gè)黑麥1～7 R的特異SSR標(biāo)記。近年來，隨著植物表達(dá)基因部分序列(EST)數(shù)據(jù)在GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/bEST_summary.html)等數(shù)據(jù)庫的大量公開，從EST中發(fā)掘SSR成為分子標(biāo)記開發(fā)簡便而有效的方法，已成功應(yīng)用于小麥[9-12]、水稻[13]、大麥[14]和花椒[15]等作物的SSR標(biāo)記開發(fā)。目前，小麥測(cè)序工作取得突破性進(jìn)展，普通小麥中國春的基因組序列公開釋放，進(jìn)一步為分子標(biāo)記的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究從普通小麥中國春2B染色體DNA序列中進(jìn)行了SSR的查找和分析，通過設(shè)計(jì)引物及有效性驗(yàn)證，旨在開發(fā)可用于小麥的新SSR標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為來自同一雜交組合的2個(gè)小麥姊妹系Cf5019-21和Cf5240-41。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SSR的查找和引物設(shè)計(jì) 從網(wǎng)站(http：//www.wheatgenome.org/)下載中國春2B染色體物理位置在159 206 132～184 196 812 bp的25 Mb DNA序列，利用SSRHunter軟件[16]查找二、三、四、五核苷酸類型的SSR位點(diǎn)(核苷酸序列的重復(fù)次數(shù)大于或等于5次)。利用Primer 5.0軟件根據(jù)查找的SSR位點(diǎn)兩側(cè)各150 bp的DNA序列設(shè)計(jì)SSR引物。引物設(shè)計(jì)的條件為：引物長度18～22 bp，退火溫度50～65 ℃，且上游和下游的引物退火溫度之差低于5 ℃，PCR擴(kuò)增片段長度100～400 bp，盡可能防止出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物命名為Xhwm加序號(hào)，例如Xhwm1。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與電泳 CTAB法提取DNA。PCR反應(yīng)體積為20 μL，含1×Buffer(0.01 mol/L Tris-HCl，pH值8.3，0.05 mol/L KCl)、0.001 5 mol/L MgCl2、0.2 mol/L dNTPs、50 ng引物和60 ng模板DNA。擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，50～60 ℃退火1 min，72 ℃延長1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延長10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)的查找

利用SSRHunter軟件在中國春2B染色體25 Mb的DNA序列中共找到2 852個(gè)SSR位點(diǎn)(表1)，這些位點(diǎn)中二核苷酸重復(fù)最多，有2 293個(gè)，占所發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)總數(shù)的80.40%，其次是三核苷酸，有537個(gè)，占所發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)總數(shù)的18.83%；四核苷酸、五核苷酸重復(fù)單元數(shù)量很低，分別僅出現(xiàn)了21，1個(gè)。

2.2 SSR分布特征及重復(fù)次數(shù)

如表2所示，在2 852個(gè)SSR中，二核苷酸重復(fù)序列有6種，其中GA/CT、AG/TC數(shù)量最多，分別占

表1 不同重復(fù)核苷酸的SSR分布Tab.1 Distribution of SSR based on different repeating nucleotides

SSR總數(shù)的20.44%，19.00%(表2)；其次為AT/TA，占SSR總數(shù)的17.15%；AC/TG、CA/GT的數(shù)量接近，分別占SSR總數(shù)的10.76%，10.31%，CG/GC的數(shù)量最少，占SSR總數(shù)的2.73%。三核苷酸重復(fù)序列共30種，其中，CTT/GAA數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的2.56%；其次是TTC/AAG、TCT/AGA、CCT/GGA，分別占SSR總數(shù)的1.79%，1.16%，1.02%；其余26種類型占SSR總數(shù)的比例均小于1.00%。四核苷酸重復(fù)序列共17種，五核苷酸僅有1種，各種重復(fù)占SSR總數(shù)的比例都較低。

表2中二核苷酸、三核苷酸分別統(tǒng)計(jì)重復(fù)次數(shù)≥10或8的SSR數(shù)量。進(jìn)一步分析SSR的重復(fù)次數(shù)，發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復(fù)次數(shù)總體較高，重復(fù)次數(shù)≥10的SSR序列有327個(gè)，占所有二核苷酸序列的14.26%，其中二核苷酸AT/TA最高重復(fù)次數(shù)達(dá)到了47次，AG/TC、AT/TA 2種重復(fù)基元中重復(fù)次數(shù)≥10的SSR序列分別有98，97個(gè)，而CG/GC僅有1個(gè)SSR序列的重復(fù)次數(shù)≥10。三核苷酸的重復(fù)次數(shù)總體偏低，重復(fù)次數(shù)≥8的SSR數(shù)量僅有62個(gè)，占所有三核苷酸序列的11.55%。其中TTC/AAG重復(fù)基元中重復(fù)次數(shù)≥8的SSR數(shù)量最多，有12個(gè)；而TAC/ATG的最高重復(fù)次數(shù)達(dá)到了33次。四核苷酸重復(fù)基元中只有ACAT/TGTA、TAGA/ATCT的重復(fù)次數(shù)分別達(dá)到了16，14次，其他重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要為5～7 次。五核苷酸TTTTA/AAAAT重復(fù)了5次。

表2 二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元的SSR分布Tab.2 SSR distribution of dinucleotide and trinucleotide types

2.3 SSR有效性驗(yàn)證

根據(jù)上述的SSR位點(diǎn)共設(shè)計(jì)了135對(duì)SSR引物，以2個(gè)小麥品系Cf5019-21和Cf5240-41的DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有101對(duì)引物在這2個(gè)材料中擴(kuò)增出了清晰的DNA條帶(表3)，占所設(shè)計(jì)SSR引物的74.81%，其中17對(duì)(16.83%)引物在二者間表現(xiàn)出差異擴(kuò)增。圖1為部分SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果。

表3 101個(gè)在小麥品系Cf5019-21和Cf5240-41上有擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR引物Tab.3 Information of 101 SSR primers which amplified clear bands in wheat lines Cf5019-21 and Cf5240-41

表3(續(xù))

M.Marker;1,2分別為Cf5019-21、Cf5240-41。M.Marker;1 and 2 are wheat lines Cf5019-21 and Cf5240-41，respectively.

3 結(jié)論與討論

Nicot等[9]發(fā)現(xiàn)，在555個(gè)小麥SSR序列中66.5%是三核苷酸重復(fù)，二核苷酸重復(fù)比例僅為15.5%；Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，在小麥2 038個(gè)SSR序列中三核苷酸重復(fù)的出現(xiàn)頻率明顯高于其他類型，達(dá)到51.1%；陳軍方等[17]在10 380個(gè)EST序列中檢索到444個(gè)SSR，其中，三核苷酸重復(fù)單元比例達(dá)到78.0%。然而，潘海濤等[12]在小麥6 314個(gè)SSR中發(fā)現(xiàn)二核苷酸和三核苷酸重復(fù)序列最多，分別達(dá)到35.4%和33.0%；Li等[1]在黑麥51 138個(gè)SSR序列中發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復(fù)序列比例最高，達(dá)到49.0%，其次是三核苷酸(38.0%)。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥2B染色體25 Mb區(qū)段的DNA序列中二核苷酸的重復(fù)類型最多，占所有SSR位點(diǎn)總數(shù)的80.40%，其次為三核苷酸重復(fù)類型，占18.83%。不同研究的核苷酸重復(fù)數(shù)的差異可能和設(shè)置的SSR查找標(biāo)準(zhǔn)及所研究的基因組或基因組區(qū)段有關(guān)。例如，本研究查找SSR序列是以二、三、四、五核苷酸SSR重復(fù)次數(shù)均大于或等于5次為標(biāo)準(zhǔn)，這在一定程度上也提高了二核苷酸重復(fù)序列的出現(xiàn)頻率。另外，本研究中GA/CT重復(fù)基元占SSR總數(shù)的比例最高(20.44%)，潘海濤等[12]和Nicot等[9]也發(fā)現(xiàn)小麥SSR序列中二核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最多的是GA/CT，該二核苷酸重復(fù)基元在黑麥、水稻、玉米、大豆和高粱中出現(xiàn)頻率也很高[18]，與本研究的結(jié)果相一致。

Nicot等[9]根據(jù)小麥SSR設(shè)計(jì)了688對(duì)引物，其中70%的引物擴(kuò)增出清晰的DNA條帶，53%的引物在8個(gè)小麥品種間表現(xiàn)多態(tài)；潘海濤等[12]根據(jù)小麥中篩選到的6 314個(gè)微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)了596對(duì)SSR引物，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)引物得分在95以上的194對(duì)引物中有165對(duì)(85%)能在3個(gè)小麥品種擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的帶型，并利用重組自交系(RIL)群體將其中的23個(gè)位點(diǎn)整合到已有的小麥遺傳圖譜上。陳軍方等[17]、劉澤濤等[19]分別在135，64對(duì)設(shè)計(jì)的SSR引物中發(fā)現(xiàn)60.7%，64.1%的引物在小麥品種擴(kuò)增出DNA條帶。Pestsova等[20]通過篩選粗山羊草基因組文庫，根據(jù)二核苷酸微衛(wèi)星設(shè)計(jì)了149對(duì)引物，其中65(43.6%)對(duì)引物在粗山羊草基因組擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片段，48對(duì)引物在小麥品種Opata85和W7984間呈現(xiàn)多態(tài)。本研究根據(jù)小麥2B染色體25 Mb區(qū)段的SSR序列設(shè)計(jì)了135對(duì)引物，有101(74.81%)對(duì)引物能在小麥品系Cf5019-21和Cf5240-41擴(kuò)增出清晰的DNA條帶，其中，17對(duì)引物在這2個(gè)材料間表現(xiàn)多態(tài)。多態(tài)引物比例(16.83%)低于Pestsova等[20]的研究結(jié)果，主要原因可能與Cf5019-21和Cf5240-41是來自同一雜交組合的姊妹系有關(guān)。本研究成功開發(fā)的小麥2B染色體SSR引物可用于小麥及其近緣植物的相關(guān)研究。