李艷美，李芳,，粟有志,，周均,，羅瓊，王靜文，王興磊*

1(伊犁師范大學(xué)，污染物化學(xué)與環(huán)境治理重點實驗室，新疆 伊寧，835000) 2(伊寧海關(guān)技術(shù)中心，新疆 伊寧，835000)

酵母產(chǎn)品是指酵母菌以糖類、糧食為原料，添加需要的營養(yǎng)素，利用相關(guān)生物技術(shù)和發(fā)酵工藝，獲得營養(yǎng)豐富的酵母制品或酵母衍生制品，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、生物制藥、釀造發(fā)酵、生物化工、石油及農(nóng)畜牧業(yè)等領(lǐng)域[1]。為提高酵母產(chǎn)品穩(wěn)定性，在生產(chǎn)工藝中加入抗氧化劑和防腐劑[2]。

食品用防腐劑和抗氧化劑可以分為復(fù)合型、天然及化學(xué)合成[3]，也可根據(jù)其起源和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類?；瘜W(xué)合成抗氧化劑和防腐劑使用簡單有效而應(yīng)用廣泛[4]。但其對人體心肝脾胃腎等臟器產(chǎn)生一定的危害[5]，歐盟等大多數(shù)國家的法規(guī)中都對其有嚴(yán)格的限量。中國GB 2760—2014也規(guī)定了最大使用限量。

檢測防腐劑和抗氧化劑的儀器方法有示波極譜法[6]、紫外分光光度法[7]、膠束電動色譜法[8]、薄層色譜法[9]、離子色譜[10]、毛細(xì)管電泳技術(shù)[11]、流動注射化學(xué)發(fā)光法[12]、紅外光譜法、比值導(dǎo)數(shù)波譜法[13]等，以上檢測方法只適用于特定的樣品基質(zhì)，且可檢測的防腐劑、抗氧化劑的品種有限。大部分防腐劑和抗氧化劑均是極性化合物到中等極性化合物，常用的檢測方法為液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[14-15]、氣相色譜(gas chromatography，GC)[16-17]、氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass，GC-MS)[18-20]、液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass,LC-MS)[21-23]等技術(shù)。而液相和氣相色譜法為半定性，氣相質(zhì)譜法提取時需要大量的有機(jī)溶劑；液相質(zhì)譜法檢測準(zhǔn)確性好，靈敏度高。

酵母產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，前處理需要有效去除基質(zhì)干擾，降低雜質(zhì)對目標(biāo)化合物的影響，本文采用試劑耗材消耗少，步驟簡單、高效、安全的QuEChERS樣品前處理技術(shù)[14，24-26]，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法確證法，建立檢測酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的方法。該方法準(zhǔn)確、可靠、快速、高效，為酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的檢測提供了實用的技術(shù)手段，對監(jiān)測酵母產(chǎn)品中添加劑的使用情況具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260-6460A HPLC-ESI-MS/MS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有自動進(jìn)樣器、四元泵、電噴霧離子源、色譜質(zhì)譜工作站)，美國安捷倫科技公司；miIIi-Q advangtage A10超純水系統(tǒng)，Millipore公司；Sigma3-18K臺式冷凍離心機(jī)，Sigma公司；ME104E電子天平(萬分之一 天平120 g/0.1 mg)，梅特勒托利多公司；SK8210LHC超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；N-EVAP-112 水浴氮吹儀，美國Organomation公司；MS3型渦旋振蕩器，德國IKA公司。

乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙醇和正己烷均為色譜純，德國MERCK公司；冰乙酸(優(yōu)級純)、乙酸銨(優(yōu)級純)，成都市科龍化工試劑廠；NaCl(99.8%),天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；試驗用水為Milli-Q超純水(符合GB/T 6682—2008一級水要求)；酸性氧化鋁(ALA)，北京振翔公司；硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2)，均購自天津博納艾杰爾科技有限公司；4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品信息詳見表1；分析樣品為實驗室送檢和市售樣品。

表1 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 1 The notice for the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

添加劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解搖勻稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液?？紤]稱樣量乘以純度后除以體積，配置后各添加劑的最終質(zhì)量濃度如下(mg/L)：EPB 999；PP 985.05；MPB 969.03；MPB 993.60，BP 980.10；BHA 968.24；Ionox-100 985.0；HR 975.0，EQ 978.04。儲存于4 ℃冰箱中備用。

中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)每種添加劑在儀器上的響應(yīng)靈敏度，確定其在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度，用水稀釋添加劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液至中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 mg/L。

1.3 樣品前處理

稱取2 g樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管，加入10 mL水，加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋振蕩超聲3 min。加入10 mL正己烷飽和的乙腈，2 500 r/min充分渦旋振蕩3 min，加入2 g NaCl，渦旋振蕩3 min后超聲5 min。10 000 r/min離心5 min， 取乙腈層5 mL于15 mL具塞離心管，40 ℃水浴氮吹至干后用流動相(V(10 mmol/L乙酸銨)∶V(甲醇)=1∶1)1 mL振蕩超聲溶解，加入100 mg C18后充分振蕩，8 000 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm針頭式濾膜至進(jìn)樣小瓶，供HPLC-ESI-MS/MS測定。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜條件：JADE-PAK C18柱(2.1 mm×100 mm, 3 μm)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；流速為0.2 mL/min；流動相：A相為10 mmol/L乙酸銨溶液，B相為甲醇，梯度洗脫程序如表2。

表2 流動洗脫程序Table 2 Flow elution program

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：防腐劑EQ正離子掃描，其他防腐劑為負(fù)離子掃描；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣、鞘氣、碰撞氣均為高純氮氣；安裝有霧化器墊片；霧化氣壓力：275.8 kPa；干燥氣流速：10 L/min；干燥氣溫度：350 ℃； 鞘氣流速：11.0 L/min，鞘氣溫度：250 ℃；毛細(xì)管電壓:3 500 V；監(jiān)測離子對、碰撞能力、碎裂電壓等參見表3。

表3 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 3 The mass parameters for the 4 antioxidants and 5 p-hydroxybenzoate antiseptics

注：*表示定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑本身的電離性質(zhì)，配制單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，在不接色譜柱，接入兩通的條件下，分別用正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式進(jìn)行母離子全掃描。

利用Mass Hunter Optimizer軟件，在MRM模式下，對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的母離子、碎裂電壓、子離子、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，獲得最佳的質(zhì)譜參數(shù)條件。

4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑二級質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 四種抗氧化劑和5種防腐劑的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS-MS spectra of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

參照歐盟指令657/2002/EEC中有關(guān)規(guī)定，選擇本底干擾最小、離子豐度最高的兩個離子對作為特征離子對，其中選擇豐度比較大的離子作為定量離子，另一個信號較大的離子對作為定性離子對。4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的定量離子和定性離子對及其他質(zhì)譜分析參數(shù)詳見表3。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

采用液相色譜-質(zhì)譜分析樣品時，流動相體系中有機(jī)相一般以乙腈、甲醇為主，水相中適當(dāng)添加一定量的緩沖物質(zhì)。緩沖鹽溶液盡可能不要用于液相色譜-質(zhì)譜的流動相，因其會污染離子源，使質(zhì)譜靈敏度下降。本章的無機(jī)相由不同比例的甲酸水、乙酸銨水、甲酸-乙酸銨水溶液組成，有機(jī)相由乙腈和甲醇組成，研究比較不同流動相的分離效果。圖2為不同流動相下9種分析物的總體響應(yīng)值比較，結(jié)果表明，甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相時，各添加劑的響應(yīng)值較高，通過設(shè)定梯度洗脫程序，4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑基線分離，可在15 min內(nèi)完成測試。

圖2 不同流動相下9種分析物的總體響應(yīng)值比較Fig.2 Comparison of response values of 9 analytes in different mobile phase

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

本試驗中的添加劑易溶于乙腈、甲醇、乙醇等溶劑，實驗比較7種不同的提取實驗方案來比較確定最優(yōu)提取劑，比較了甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(體積比5∶5)、甲醇-乙腈(體積比5∶5)、乙醇-乙腈(體積比5∶5)、正己烷飽和乙腈的提取效果。從圖3不同提取溶劑對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的提取回收率可以看出，甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(體積比5∶5)、甲醇-乙腈(體積比5∶5)、乙醇-乙腈(體積比5∶5)提取時大部分防腐劑的回收率低于60%，達(dá)不到檢測要求；用純乙腈提取時，雖然提取回收率為86%～123%，但提取上機(jī)后基質(zhì)影響比較大；在提取之前先用乙腈飽和的正己烷溶解，降低溶液的黏度，再用正己烷飽和的乙腈進(jìn)行提取時4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的提取回收率為89.8%～122%，回收率滿足檢測要求。

圖3 不同提取劑下9種分析物的回收率Fig.3 Recovery of 9 analytes from different extraction agents

2.2.2 凈化劑的選擇

為選取實驗前處理所用最為適宜的凈化劑，本實驗比較了酸性氧化鋁(ALA)、硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2)7種吸附劑對樣品的凈化效果來進(jìn)行吸附實驗。實驗中PCX對EPB和PP有吸附，回收率僅為38%～55%；PSA對于Ionox-100回收率為55%左右；SPE對于大部分對羥基苯甲酸類防腐劑的回收率約為65%；-NH2做吸附劑時對EPB有吸附，Al2O3對Ionox-100和HR的回收率達(dá)不到檢測要求；PEP對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑回收率為75%；這7種凈化劑中只有C18對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑都不吸附，回收率為97%～108%。所以選擇C18可以作為實驗的凈化劑。酵母抽提物樣品中不同凈化劑對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率效果見圖4。

圖4 不同凈化劑下4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的凈化回收率Fig.4 Purification and recovery rate of the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics under different purification agents

2.2.3 凈化劑使用量的選擇

凈化劑C18用量的優(yōu)化：實驗加入C18的量分別為25、50、100、150、200、300 mg。酵母產(chǎn)品中C18加入不同量時對4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率效果發(fā)現(xiàn)，加入量為25和50 mg時凈雜質(zhì)峰去除不明顯，當(dāng)加入至100 mg時，基線明顯平穩(wěn)，加入量為150、200、300 mg時與加入100 mg時吸附雜質(zhì)效果相當(dāng)。最終選擇的凈化劑用量為100 mg。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

經(jīng)過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，以選擇離子監(jiān)測模式掃描進(jìn)行分析測定，以防腐劑的濃度為橫坐標(biāo)(x)，特征碎片離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑在0.1～10 mg/L的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992?？瞻讟悠钒凑?.2.1節(jié)方法前處理樣品，以信噪比(S/N)≥3時確定方法的檢出限(limits of detection,LOD)，其范圍為0.03～0.15 mg/kg；以S/N≥10確定方法的定量限(limits of quantification,LOQ)，為0.10～0.5 mg/kg。4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限詳見表4。

表4 四種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的線性方程、檢出限和定量限Table 4 Regression equation, correlation coefficient, limits of detection, limits of quantification of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

以活性干酵母和酵母抽提物陰性樣品為空白，以1、3、10 倍LOQ為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率實驗。添加了防腐劑在酵母產(chǎn)品中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品，按照1.2節(jié)方法和儀器條件進(jìn)行前處理和儀器測定，每個水平重復(fù)6次。回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5?；钚愿山湍钢?種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率在78.9%～108.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.2%～15.8%； 酵母抽提物中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的回收率在82.9%～107.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.7%～14.5%，表明該方法的準(zhǔn)確度高，通用性好。

2.5 實際樣品測定

應(yīng)用本方法對36批活性干酵母和28份酵母抽提物中 4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑進(jìn)行分析，在這些樣品中均未檢出，應(yīng)用本方法能有效降低基質(zhì)干擾，加標(biāo)回收率良好，滿足實際樣品分析的要求。

表5 不同酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類 防腐劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics by standard addition method with yeast products

續(xù)表5

抗氧化劑加標(biāo)水平/(mg·kg-1)活性干酵母酵母抽提物回收率/%RSDs/%回收率/%RSDs/%0.2092.312.388.810.3BHA0.60106.410.2105.112.42.0095.48.287.78.20.1086.49.982.95.9Ionox-1000.30103.612.198.610.51.0094.710.095.413.10.5095.214.186.89.1HR1.00101.66.390.85.05.0093.84.295.34.70.1082.58.8102.56.4EQ0.3081.511.198.37.81.0096.910.5106.65.6

3 結(jié)論

本章研究建立了以正己烷飽和的乙腈為提取劑，經(jīng)QuEChERS前處理，C18凈化，酵母粉和酵母抽提物中對羥基苯甲酸乙酯(EPB)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸甲酯(MPB)、對羥基苯甲酸正丁酯(BP)、叔丁基對羥基苯甲醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、4-正己基間苯二酚(HR)乙氧喹啉(EQ)共計4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，在0.1～10 mg/L相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.992，3個加標(biāo)水平(1、3、10倍定量限)下，活性干酵母中的回收率78.9%～108.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.2%～15.8%；酵母抽提物中的回收率82.9%～107.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差4.7%～14.5%。 該方法快速簡便、準(zhǔn)確可靠，精密度好、回收率高，方法可以滿足實驗室高通量復(fù)酵母產(chǎn)品中4種抗氧化劑和5種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的檢測需求?？蔀榻湍府a(chǎn)品中此類物質(zhì)的檢測提供可靠的技術(shù)支持，為建立行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。