雷 寶，王生海，王正梅，宋延峰，杜彩霞，王 璐*

(1.延安大學醫(yī)學院；2.延安市中醫(yī)院麻醉科，陜西 延安 716000)

高烏甲素又名拉巴烏頭堿(lappaconitine)，是從毛茛科植物高烏頭的根中提取的一種生物堿。氫溴酸高烏甲素具有較強的鎮(zhèn)痛作用，另外還有抗炎消腫、降溫解熱與局部麻醉作用，鎮(zhèn)痛強度是氨基比林的7倍，與哌替啶的鎮(zhèn)痛效果相當[1]。研究表明高烏甲素在甲醛溶液、鹿角菜膠致炎及佐劑性關節(jié)炎3種炎癥性疼痛模型中均有明顯的鎮(zhèn)痛作用[2]。然而，高烏甲素是對炎癥性疼痛的陣痛作用的機制尚不清楚。近年來神經(jīng)科學領域的研宄確切地證實了膠質細胞，尤其是星形膠質細胞和小膠質細胞在神經(jīng)炎癥和慢性痛中發(fā)揮重要的作用[3]。因此，本研究利用炎癥性疼痛模型，研究脊髓中膠質細胞激活情況，進一步闡明對高烏甲素對炎癥性疼痛的作用機制，為臨床用藥提供可靠的藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠購于西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。于溫度(25.0±0.5℃)、相對濕度(50±5%)、明暗期(12/12h)的籠子里飼養(yǎng)，自由進食和飲水。大鼠給藥前禁食不禁水12 h。

1.2 試劑

高烏甲素購于西安惠博生物科技有限公司。CFA(弗氏佐劑)購于Sigma 公司，GFAP單克隆抗體(abcam公司)，OX-42單克隆抗體(abcam公司)。

1.3 模型制備、分組、取材

預處理組：單側(左側)足底注射完全弗氏佐劑(CFA)前一天開始分別尾靜脈注射溶劑(生理鹽水)或高烏甲素溶液(低劑量組2 mg/kg，高劑量組10 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。分組：正常組，vehicle組，高烏甲素低劑量，高烏甲素高劑量組。取材部位：脊髓腰膨大L4-5段，取材前對大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，用生理鹽水經(jīng)心臟灌流沖凈血液。后處理組：單側(左側)足底注射完全弗氏佐劑(CFA)后2 d，注射溶劑(生理鹽水)或高烏甲素溶液(低劑量組2 mg/kg，高劑量組10 mg/kg)，每天1次，連續(xù)5 d。分組同上。

1.4 行為學檢測

行為檢測前，各大鼠單獨放在測試架上的有機玻璃籠中室溫控制在25.0±0.5℃，適應環(huán)境至安靜。

機械性刺激縮爪域值測定：按照Dixon等報道的方法[4]，測試環(huán)境為10×20×20 cm有機玻璃籠，釆用0.6～20 g的Von-Frey尼龍纖維，垂直刺激動物后肢足掌中心部位。用一定強度的纖毛刺激，纖毛適度彎曲時計時，持續(xù)刺激時間為3 d，連續(xù)刺激5次，每次間隔5 s。纖毛刺激時，伴隨著動物產(chǎn)生縮爪反應，則為有效反應(Positive respond)；而5次刺激反應中，其中3次以上出現(xiàn)有效反應，則認為該纖毛的剌激強度為有效強度(Positive Intensity)反之，則為無效強度(Negative Intensity)。

熱痛覺過敏測定：安靜環(huán)境中，將大鼠放入福射熱測痛儀的玻璃格子中，全身可以自由活動。待大鼠靜置20 min后，用強光照射大鼠腳掌，測定大鼠的縮爪潛伏期(paw withdrawal latency ,PWL)，每間隔10 min測定一次，取三次測定結果的平均值作為測定結果。

1.5 免疫熒光染色

脊髓腰膨大L4-5段組織經(jīng)固定、脫水、包埋后，冰凍切片機連續(xù)切片(8 μm)。經(jīng)GFAP和OX-42單克隆抗體4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h后，于正置熒光顯微鏡照片。

1.6 實時熒光定量PCR

取大鼠脊髓腰膨大L4-5段組織，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，鑒定RNA的純度及完整性( A260/ A280范圍1.6～2.0，且凝膠電泳顯示18S和28S條清晰)。參照逆轉錄試劑盒操作規(guī)程合成25 μL cDNA，PCR擴增GFAP和OX-42基因片段。GFAP引物序列上游5’-TGGAGCTCAATGACCGCTTT-3’,下游5’-TCATCCGCCTCCTGTCTGTA-3’ (313 bp)；OX-42引物序列上游5’-ACCACTCATTGTGGGCAGCTC-3’,下游5’-CACCGGCTTCATTCATCATGTC- 3’ (629 bp)；內參基因GAPDH上游5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’，下游5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’ (195 bp)。結果分析采用2δδCT法計算各基因的相對表達量。

1.7 Western blot檢測大鼠脊髓組織GFAP和OX-42的蛋白表達

提取脊髓腰膨大L4-5段組織總蛋白，SDS-PAGE法電泳后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，經(jīng)封閉液封閉加入稀釋的一抗(1∶1000稀釋)，4℃下孵育過夜，加入HRP標記的二抗(1∶1000稀釋)，室溫下孵育2 h后。利用ECL顯色劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，分析目標條帶的灰度值異。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 高烏甲素對CFA誘導的大鼠疼痛的影響

各處理組每天藥物注射后3 h，6 h，24 h檢測機械痛敏(見圖1D,E,F)和熱痛敏行為(見圖1A,B,C)，末次藥物注射24 h后檢測對應的機械痛敏和熱痛敏行為。結果顯示，高烏甲素低劑量(2 mg/kg)和高劑量(10 mg/kg)均不會影響SD大鼠的機械痛敏和熱痛敏行為(見圖1A,D)。和vehicle組比較，高烏甲素低劑量(2 mg/kg)和高劑量(10 mg/kg)組均能緩解SD大鼠的機械痛敏和熱痛敏行為(見圖1，B,C,E,F)。

2.2 免疫熒光染色檢測脊髓中GFAP和OX-42表達

脊髓腰膨大L4-5段免疫熒光結果顯示(見圖2)。與正常組比較，溶劑組中GFAP和OX-42的表達量明顯提高；高烏甲素給藥組中OX-42的表達量比低于溶劑組，然而溶劑組和高烏甲素給藥組中GFAP表達量沒有明顯差異。

圖1 高烏甲素對CFA誘導的大鼠疼痛的影響A,B,C為熱痛敏值，D,E,F為機械痛敏值。A,D不注射CFA；B,E為預處理組；C,F為后處理組

圖2 免疫熒光染色檢測脊髓中GFAP和OX-42表達A.正常組GFAP熒光圖。B.溶劑組GFAP熒光圖。C.高烏甲素高劑量組GFAP熒光圖。D.正常組OX-42熒光圖。E.溶劑組OX-42熒光圖。F.高烏甲素高劑量組OX-42熒光圖

2.3 高烏甲素對CFA誘導大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42轉錄水平的影響

實時熒光定量PCR檢測各組大鼠脊髓腰膨大L4-5段組織中GFAP和OX-42基因在轉錄水平的變化(見圖3A,B)。結果顯示，和正常組比較，vehicle組(生理鹽水)中GFAP和OX-42基因在轉錄水平均顯著升高(P<0.05)。溶劑組比較，高烏甲素組中GFAP基因在轉錄水平無明顯差異(P>0.05)；然而，高烏甲素高劑量組中OX-42基因在轉錄水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 高烏甲素對CFA誘導的大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42轉錄水平的影響

注：A.GFAP mRNA的相對表達量；B.OX-42 mRNA的相對表達量。和正常組比較，*P<0.05,***P<0.001 ；和vehicle組比較，++P<0.01

2.4 高烏甲素多CFA誘導大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42蛋白的影響

Western blot法檢測GFAP和OX-42蛋白的變化(見圖4，A,B)。結果顯示，和正常組比較，vehicle組(生理鹽水)中GFAP和OX-42蛋白均顯著升高(P<0.05)。溶劑組比較，高烏甲素組中GFAP蛋白無明顯差異(P>0.05)；然而，高烏甲素高劑量組中OX-42蛋白顯著降低(P<0.05)。

圖4 高烏甲素對CFA誘導的大鼠脊髓組織中GFAP和OX-42翻譯水平的影響

注：A.GFAP蛋白的相對表達量；B.OX-42蛋白的相對表達量。和正常組比較，*P<0.05,**P<0.01；和vehicle組比較，+P<0.05

3 討論

疼痛是一種不愉快的主觀感覺和體驗，是臨床最常見的癥狀之一。慢性痛也稱病理性疼痛，在臨床上表現(xiàn)為對傷害性剌激敏感性增強和反應閾值降低的痛覺過敏。炎癥性疼痛是慢性痛的一種，是由創(chuàng)傷、細菌或病毒感染、化學物質以及外科手術等引起的外周組織損傷導致的炎癥引起的疼痛。本研究表明，針對CFA誘導的炎癥性疼痛模型大鼠中，高烏甲素前處理組和后處理組均有明顯的疼痛效果(見圖1，B,C,E,F)，與劉銘佩[2]的研究結果基本一致。本研究首次采用高烏甲素預處理給藥方法，并且結果顯示在預處理組中，注射CFA后24 h顯示出明顯陣痛效果(見圖1，B)；然而，在后處理組中，48 h后才能觀察到陣痛效果(見圖1，C)，提示高烏甲素預處理給藥方法有更好的陣痛效果。

本研究結果表明，實時熒光定量PCR和Western blot方法均顯示vehicle組脊髓腰膨大L4-5段組織中OX-42和GFAP基因轉錄水平和蛋白水平均較正常組顯著升高(P<0.05)，且免疫熒光染色結果表明OX-42和GFAP表達數(shù)量顯著增加。膠質細胞被激活后，釋放多種因子，如促炎的細胞因子、趨化因子、反應性氧簇等，參與神經(jīng)炎癥反應發(fā)生，直接誘導神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生[5-7]。提示CFA刺激后的炎癥疼痛模型能激活星形膠質細胞和小膠質細胞，導致疼痛的發(fā)生。在高烏甲素給藥組脊髓組織中，與vehicle組比較，GFAP基因轉錄水平和蛋白水平均無顯著變化(P>0.05)；然而，OX-42基因轉錄水平和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，同時脊髓腰膨大L4-5段OX-42表達數(shù)量明顯減少(P<0.05)。表明高烏甲素能抑制脊髓小膠質細胞的激活，但不影響星形膠質細胞的活化，暗示高烏甲素對炎癥性疼痛的陣痛作用可能通過抑制小膠質細胞活化，減少參與炎癥反應的促炎因子，趨化因子等成分的釋放，最終抑制疼痛的發(fā)生。