劉紅萍，趙 琳，龍?jiān)丛瑮钔窳?，?燕，黃 健，閔 迅，張 濤*

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563006；2.遂寧市中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川 遂寧 629000)

金銀花(Lonicerajaponica)為忍冬科忍冬屬植物忍冬干燥的花蕾和待初開的花，主要分布于貴州、河南、山東和湖北等地，其經(jīng)濟(jì)、食用及藥用價(jià)值較高，屬藥食同源植物。金銀花作為歷史悠久的中草藥，在神農(nóng)本草經(jīng)中被列為上品，其具有抗病毒、抗腫瘤、提高免疫及抗氧化等諸多功效[1-2]，其藥物活性成分主要是多糖、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類和三萜皂苷類等物質(zhì)[3-5]。多糖作為植物中的一種重要生物大分子，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒等多種功能[6-8]。但是，到目前為止，關(guān)于金銀花多糖抗氧化活性方面的研究?jī)H僅停留在金銀花粗多糖或總糖上。周立等[9]通過優(yōu)化金銀花多糖的復(fù)合酶法提取工藝，僅評(píng)價(jià)了金銀花總糖的抗氧化活性。向佳蘭等[10]采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了超聲提取金銀花總糖的條件，也僅研究了金銀花總糖的抗氧化活性。李爾春[11]雖然嘗試對(duì)金銀花總糖進(jìn)行了分離純化，但對(duì)于金銀花多糖抗氧化活性方面的研究也僅局限于金銀花總糖。目前，金銀花總糖中主要抗氧化活性多糖組分尚不明確，阻礙了金銀花多糖結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的深入研究。鑒于此，通過沸水煮提、乙醇醇沉并聯(lián)合采用DEAE-纖維素柱層析和凝膠排阻色譜對(duì)金銀花粗多糖(LJP)進(jìn)行分離純化，最后采用單因素試驗(yàn)研究金銀花多糖對(duì)4種氧化劑的體外抗氧化作用，旨在為金銀花多糖的綜合開發(fā)和利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 金銀花 購(gòu)于貴州省遵義市綏陽(yáng)縣市場(chǎng)。

1.1.2 試劑 維生素C、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、FeSO4和水楊酸，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；間羥基聯(lián)苯、氨基磺酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)均購(gòu)于Sigma，以上試劑均為分析純。稱量磷酸二氫鈉4.992 3 g和磷酸氫二鈉17.906 g，用超純水定溶于820 mL，配制pH 7.0 0.1 mol/L的PBS溶液。稱量PMP 4.355 g，用無水甲醇定溶于50 mL，配制0.5 M的PMP甲醇溶液。

1.1.3 儀器與設(shè)備 723型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；FA1004C電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥器，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BT100MH創(chuàng)銳蠕動(dòng)泵，保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；Waters e2695配備2489型紫外檢測(cè)器，美國(guó)沃特世公司；Cl-型 DEAE-纖維素離子交換柱(2.6 cm×50 cm)，上?；瘜W(xué)試劑廠；Tensor 27布魯克傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金銀花粗多糖的提取與分離純化

1)提取。參照?qǐng)D1制備流程，稱取干燥金銀花500 g，置于裝有14 L蒸餾水的容器中，100℃煮提4 h，過濾；向殘?jiān)性偌尤? L蒸餾水煮提3 h，過濾；向殘?jiān)性偌尤? L蒸餾水煮提2 h，過濾。合并3次濾液并濃縮至約600 mL，4 000 r/min離心10 min，收集上清液并加入1 800 mL無水乙醇，靜置過夜。次日，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀并凍干即得金銀花粗多糖。分別采用苯酚-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法和考馬斯亮藍(lán)法分析金銀花粗多糖中糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量[9]。

2)分離純化。稱取2 g金銀花粗多糖溶于20 mL蒸餾水中，上樣于DEAE-纖維素離子交換柱。依次用600 mL的去離子水和600 mL 0.5 M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速2 mL/min，每20 mL洗脫液收集1管。采用苯酚-硫酸法和間羥基聯(lián)苯法分別檢測(cè)洗脫液中糖和糖醛酸的含量。以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線[9]。根據(jù)洗脫曲線收集相應(yīng)的洗脫液，透析除鹽后凍干備用。

圖1 金銀花粗多糖的制備流程Fig.1 Preparation flow chart of crude L.japonica polysaccharide

1.2.2 金銀花多糖組成成分分析

1)單糖組成。將2 mg金銀花多糖置于水解瓶中，加入1.0 mL 2 M 鹽酸甲醇，于80℃反應(yīng)16 h；氮?dú)獯蹈珊蠹尤?.0 mL 2 M 三氟乙酸溶液，于120℃水解1 h；將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入適量的無水乙醇，蒸干。向蒸干的水解產(chǎn)物中加入0.5 mL PMP和0.5 mL 0.3 M NaOH溶液，70℃反應(yīng)30 min；再加入0.5 mL 0.3 M HCl溶液及0.9 mL氯仿萃取未反應(yīng)的PMP；最后用0.22 μm濾膜過濾，過濾后的得到衍生化產(chǎn)物濾液待HPLC分析。HPLC分析條件：采用Waters e2695配備2489型紫外檢測(cè)器，Dikma Platisil ODS色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，乙腈∶PBS=18.2∶81.8(V/V)，流速1.0 mL/min，柱溫35℃[12]。

2)多糖各組分的均一性及分子量檢測(cè)。分別稱取金銀花各多糖組分10 mg，溶于0.1 M NaCl溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，上樣于Sepharose CL-6B柱進(jìn)行層析分析，洗脫液為0.1 M NaCl水溶液，流速為0.15 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)品右旋葡聚糖系列(平均分子量為0.18 kDa、10 kDa、50 kDa、100 kDa、800 kDa和2 000 kDa)。以上述標(biāo)準(zhǔn)聚糖分子量的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及金銀花多糖的保留時(shí)間計(jì)算金銀花各多糖組分的平均分子量。

3)多糖各組分的紅外光譜檢測(cè)。中草藥多糖的藥理活性與多糖結(jié)構(gòu)的關(guān)系密切，為探索金銀花多糖不同級(jí)分的基本結(jié)構(gòu)的差異，采用傅里葉變換紅外光譜對(duì)金銀花多糖的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。稱取充分干燥后的金銀花多糖樣品約2 mg與KBr(溴化鉀)粉末約100 mg混勻后研磨壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀內(nèi)，常溫下掃描400～4 000 cm-1的波長(zhǎng)區(qū)間，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.2.3 金銀花多糖各組分的抗氧化活性

1)對(duì)DPPH的清除能力。分別將金銀花多糖各組分溶于蒸餾水中，配成不同濃度的溶液(0、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL和4.0 mg/mL)。取各濃度溶液2 mL分別與2 mL DPPH甲醇溶液(0.2 mM)混合，避光孵育20 min。以去離子水為空白對(duì)照，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，于517 nm處測(cè)定各管的吸光度，3次重復(fù)。計(jì)算金銀花多糖各組分的DPPH清除率(Y1)。

Y1=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中，A1為樣品與DPPH溶液反應(yīng)后在517 nm處的吸光值，A2為甲醇與樣品溶液反應(yīng)后在517 nm處的吸光值，A0為去離子水與DPPH溶液反應(yīng)后在517 nm處的吸光值[13]。

2)對(duì)羥基自由基的清除能力。將金銀花多糖溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液(0、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL和4.0 mg/mL)。上述多糖溶液各取0.5 mL，與0.5 mL H2O2(8.8 mM)、0.5 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)和0.5 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)混合，于37℃水浴0.5 h。以去離子水作空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)定各管的吸光度，3次重復(fù)。計(jì)算金銀花多糖各組分對(duì)羥基自由基的清除率(Y2)。

Y2=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中，A0為去離子水作空白對(duì)照的吸光值，A1為多糖樣品反應(yīng)后的吸光值，A2為去離子水代替H2O2作為多糖的本底對(duì)照的吸光值[13]。

3)對(duì)ABTS的清除能力。用蒸餾水配制2.6 mmol/L過硫酸鉀，用過硫酸鉀配制7.4 mmol/L ABTS儲(chǔ)備液，室溫避光，靜置過夜，用時(shí)取儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋29.33倍。將金銀花多糖各組分溶于蒸餾水中，配成系列濃度的溶液(0、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL和4.0 mg/mL)。在反應(yīng)體系中加入上述不同濃度多糖溶液0.1 mL及1 mL ABTS測(cè)定液，室溫避光6 min。以蒸餾水代替樣本作參比測(cè)定吸光值(A0)，以蒸餾水代替ABTS測(cè)定液作為多糖的本底吸光值(A2)，在734 nm處測(cè)定各多糖的吸光值(A1)，3次重復(fù)。計(jì)算金銀花多糖各組分對(duì)ABTS的清除率(Y3)。

Y3=[1-(A1-A2)/A0]×100%

4)對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制作用。將金銀花多糖各組分溶于生理鹽水中，配成系列濃度的溶液(0、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和2.0 mg/mL)。在反應(yīng)體系中加入0.5% RBC懸浮液0.5 mL，不同濃度多糖溶液0.5 mL，最后加入0.1 mol/L H2O2溶液0.5 mL，混勻，37℃水浴60 min，用生理鹽水稀釋2倍，3 000 r/min離心10 min，取上清液于415 nm處測(cè)定吸光值(A)。正常組以生理鹽水代替樣本和H2O2，模型組以生理鹽水代替樣本，3次重復(fù)。計(jì)算金銀花多糖各組分對(duì)RBS溶血的抑制率(Y4)。

Y4=(A模型組-A樣本組)/(A模型組-A正常組)×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 6進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花多糖的制備、分離與純化

經(jīng)水煮、乙醇醇沉和凍干等步驟，500 g金銀花共提取到黃棕色的金銀花粗多糖26.5 g，提取率為5.3%。金銀花粗多糖中糖含量為78.0%，糖醛酸含量為40.0%，蛋白質(zhì)含量為5.2%。從圖2可見，金銀花粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱層析分離純化得到1個(gè)去離子水洗脫的中性糖級(jí)分LJP-N和1個(gè)0.5 M NaCl洗脫的酸性糖級(jí)分LJP-A，分別占粗多糖的33.0%和54.1%。

圖2 金銀花多糖經(jīng)DEAE 纖維素柱層析分離純化的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of L.japonica polysaccharide purified by DEAE-cellulose column chromatography

2.2 金銀花多糖的組成成分

2.2.1 單糖組成 從圖3看出，金銀花粗多糖主要由GalA(56.0%)、Ara(16.6%)、Glc(12.5%)、Gal(11.4%)和Rha(1.2%)構(gòu)成；中性糖級(jí)分LJP-N主要由Glc(43.7%)、Gal(25.1%)和Ara(31.2%)構(gòu)成，表明，LJP-N主要由淀粉樣葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成，無酸性糖成分；酸性糖級(jí)分LJP-A主要含有GalA(82.1%)、Gal(7.1%)和Ara(10.8%)，表明，LJP-A主要由同型聚半乳糖醛酸以及少量的阿拉伯半乳聚糖組成，Gal和Ara通過共價(jià)鍵連接在GalA構(gòu)成的主鏈上，隨著同型聚半乳糖醛酸一起被0.5 M NaCl洗脫下來。此外，LJP-N和LJP-A的單糖組成也表明DEAE-纖維素柱層析成功地將金銀花粗多糖分成了中性糖級(jí)分和酸性糖級(jí)分，分離純化效果較好。

注：Man，甘露糖；Rha，鼠李糖；GlcA，葡萄糖醛酸；GalA，半乳糖醛酸；Glc，葡萄糖；Gal，半乳糖；Xyl，木糖；Ara，阿拉伯糖；Fuc，巖藻糖。
Note:Man,mannose;Rha,rhamnose;GlcA,glucuronic acid;GalA,galacturonic acid;Glc,glucose;Gal,galactose;Xyl,xylose;Ara,arabinose;Fuc,fucose.

圖3金銀花多糖的單糖組成
Fig.3 Monosaccharide composition ofL.japonicapolysaccharide

2.2.2 多糖的分子量 從圖4看出，金銀花多糖級(jí)分LJP-N和LJP-A的分子量均一性均良好；根據(jù)圖4顯示LJP-N和LJP-A的吸光度計(jì)算得出，LJP-N的平均分子量為6 kDa，LJP-A的為400 kDa，是LJP-N的67倍。表明，分子量較大的酸性糖級(jí)分是金銀花粗多糖的主要成分。

2.2.3 多糖的紅外光譜分析 從金銀花多糖級(jí)分LJP-N和LJP-A的傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)結(jié)果(圖5)看出，3 400 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于羥基的伸縮振動(dòng)峰，2 946 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于CH2的C-H的伸縮振動(dòng)峰，1 630 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于羥基的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 413 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于C-H的變形吸收峰，1 070 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于β-Gal的羥基變角振動(dòng)特征峰，1 049 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于α-Ara的羥基變角振動(dòng)特征峰，920 cm-1和833 cm-1對(duì)應(yīng)于α-Glc的特征吸收峰。表明，金銀花中性糖級(jí)分LJP-N主要由淀粉樣葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖構(gòu)成。1 742 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于羰基的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 619 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于羰基的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 101 cm-1和1 019 cm-1附件的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)于糖醛酸的特征吸收峰。表明，金銀花酸性糖級(jí)分LJP-A主要由同型聚半乳糖醛酸構(gòu)成。上述結(jié)果均分別與二者單糖組成的結(jié)果相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了LJP-N主要含有淀粉樣葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖，LJP-A主要含有聚半乳糖醛酸。

注：Vo，外水體積；Vt，總體積。
Note:Vo,external water volume;Vt,total volume.

圖4金銀花多糖級(jí)分 LJP-N和 LJP-A于 Sepharose CL-6B上的洗脫曲線
Fig.4 Elution curves ofL.japonicapolysaccharide fractions LJP-N and LJP-A on Sepharose CL-6B

圖5金銀花多糖級(jí)分 LJP-N和 LJP-A的紅外光譜
Fig.5 Infrared spectra ofL.japonicapolysaccharide fractions LJP-N and LJP-A

2.4 金銀花多糖的抗氧化活性

從圖6看出金銀花粗多糖及其各子級(jí)分的抗氧化活性。

2.4.1 對(duì)DPPH的清除能力 金銀花多糖級(jí)分LJP-N和LJP-A均具有明顯清除DPPH自由基的能力，二者隨著濃度的增加，活性逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)LJP-A的濃度增至2 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除能力接近于抗壞血酸，EC50約為0.58 mg/mL。LJP-N的活性較LJP-A弱，當(dāng)其濃度增至4 mg/mL時(shí)，清除能力也未達(dá)80%，EC50約為2.23 mg/mL。

2.4.2 對(duì)羥基自由基的清除能力 金銀花多糖級(jí)分LJP-N和LJP-A均具有清除羥基自由基的能力，但均明顯弱于抗壞血酸。LJP-A隨著濃度的增加，活性也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，當(dāng)其濃度增加至4 mg/mL，其對(duì)羥基自由基的清除率約為60%，EC50約為3.61 mg/mL。LJP-N的活性較LJP-A弱，當(dāng)其濃度增加至4 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率<20%。

2.4.3 對(duì)ABTS的清除能力 金銀花多糖級(jí)分LJP-A均具有較強(qiáng)地清除ABTS自由基的能力。LJP-A隨著濃度的增加，活性逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，當(dāng)其濃度增至4 mg/mL時(shí)，其活性已趨近于抗壞血酸的活性，其EC50約為1.4 mg/mL。LJP-N的活性較LJP-A弱，當(dāng)其濃度增至4 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率不足40%。

2.4.4 對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制作用 金銀花多糖級(jí)分LJP-N和LJP-A對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血均具有較強(qiáng)的抑制作用，且二者隨濃度的增加，活性也逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。當(dāng)LJP-A的濃度≥0.25 mg/mL時(shí)，其活性相當(dāng)于抗壞血酸的活性，EC50約為0.1 mg/mL。LJP-N的活性較LJP-A弱，但其濃度增至2 mg/mL時(shí)，其抑制率>80%，對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血展現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，其EC50約為0.25 mg/mL。

綜上所述，LJP-A和LJP-N對(duì)DPPH均具有良好的清除能力，且二者對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血具有較好的抑制作用，這可能和LJP-N和LJP-A中含有較多的阿拉伯半乳聚糖密切相關(guān)；而酸性糖組分LJP-A對(duì)羥基自由基和ABTS自由基的清除能力明顯強(qiáng)于中性糖組分，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，推測(cè)可能是由于LJP-A中含量較高的半乳糖醛酸發(fā)揮了重要作用。說明金銀花多糖中中性糖組分和酸性糖組分在抗氧化的機(jī)制方面存在差異，金銀花多糖可以通過多種途徑發(fā)揮抗氧化的作用。金銀花多糖的不同級(jí)分表現(xiàn)出不同的體外抗氧化活性。綜合運(yùn)用上述4種氧化劑檢測(cè)方法從不同角度系統(tǒng)評(píng)價(jià)了金銀花的抗氧化活性，避免了單一抗氧化方法評(píng)價(jià)抗氧化活性的片面和不足，可為金銀花多糖在天然抗氧化劑方面的研究和綜合開發(fā)利用奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

圖6 金銀花多糖組分 LJP-N和LJP-A 的體外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity in vitro of L.japonica polysaccharide fractions LJP-N and LJP-A

3 結(jié)論與討論

通過熱水煮提制備金銀花粗多糖LJP，隨后采用DEAE-纖維素柱層析聯(lián)合分子篩Sepharose CL-6B對(duì)LJP進(jìn)行分離純化得到1種中性糖組分LJP-N和1種酸性糖組分LJP-A，前者可能為淀粉樣葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成的混合物，平均分子量約為6 kDa；后者可能為同型聚半乳糖醛酸以及少量的阿拉伯半乳聚糖組成的混合物，平均分子量約為400 kDa。通過檢測(cè)金銀花多糖各組成成分對(duì)DPPH、羥基自由基和ABTS的清除能力和對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制作用，綜合分析了LJP-N和LJP-A的體外抗氧化活性，其中，LJP-A對(duì)DPPH、羥基自由基和ABTS均具有良好的清除能力，而LJP-N僅對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力；LJP-A和LJP-N對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化性溶血均具有較好的抑制作用，且均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。推測(cè)，金銀花多糖能夠通過多種途徑發(fā)揮自身的抗氧化作用。該研究結(jié)果將為金銀花多糖開發(fā)具有抗氧化功能的藥品或保健品提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)而對(duì)金銀花的深度開發(fā)和利用有一定的促進(jìn)作用。