劉美　解昆侖　劉茜　古勤生

摘 ? ?要： 黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我國重要的檢疫性病毒。2018年寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市種植的西瓜部分發(fā)生了嚴(yán)重倒瓤，通過實(shí)地調(diào)研，對發(fā)病西瓜植株的葉片和果實(shí)癥狀進(jìn)行現(xiàn)場觀察，初步懷疑為CGMMV侵染所致。對采集的3份西瓜病樣采用ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbnent Assay）和RT-PCR（Reverse Transcription PCR）檢測，以及克隆的外殼蛋白基因（CP）序列分析，結(jié)果表明，3份樣品均感染了CGMMV，證實(shí)寧夏回族自治區(qū)西瓜發(fā)生倒瓤是由CGMMV引起，這也是首次發(fā)現(xiàn)CGMMV在寧夏發(fā)生。

關(guān)鍵詞： 西瓜; 寧夏; 黃瓜綠斑駁花葉病毒

Occurence of Cucumber green mottle mosaic virus in grafted watermelon in Ningxia Hui Autonomous Region of China

LIU Mei，XIE Kunlun， LIU Xi， GU Qinsheng

（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，Henan，China）

Abstract： Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus in China. In 2018， the watermelon plants in Ningxia Hui autonomous region was seriously infected. Through field investigation， it was initially suspected to be caused by the infection of the virus by the observation of the symptoms of watermelon leaves and fruits. For the detection of the virus， ELISA （Enzym Linked Immuno-Sorbent Assay） and RT-PCR （Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） detection and sequence analysis were performed on three watermelon samples. The results showed that all the three samples were infected with CGMMV， which confirmed that watermelon fruit blood flesh in Ningxia Hui autonomous region was caused by CGMMV. The virus was first reported in Ningxia.

Key words： Watermelon;Ningxia;Cucumber green mottle mosaic virus

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）于1935年在英國感病黃瓜上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]，該病毒在自然條件下主要侵染黃瓜、西瓜、甜瓜和瓠瓜等多種葫蘆科作物[2]，通過種子、水、土壤和機(jī)械摩擦等多種方式傳播，病害蔓延擴(kuò)散迅速[3]。目前已在40多個國家或地區(qū)內(nèi)報(bào)道發(fā)生[4]。2007年有報(bào)道稱，2005年CGMMV在我國遼寧省蓋州市侵染西瓜面積達(dá)333 hm2，絕收的約13 hm2，已在我國部分地區(qū)造成西瓜毀滅性死亡[5]。被該病毒侵染發(fā)病后的西瓜表現(xiàn)為葉緣出現(xiàn)不規(guī)則斑駁，綠色突起或泡狀，近葉脈部分正常，葉片老化后則癥狀不明顯;部分葉片有時出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，果柄上有褐色的壞死斑，是該病毒侵染西瓜果實(shí)的主要特征;果實(shí)表面具有濃綠色近圓形斑紋，果肉接近果皮部分呈黃色水漬狀，然后內(nèi)部西瓜種子周邊果肉變?yōu)樽霞t色或暗紅色水漬狀;內(nèi)部含有大量塊狀黃色纖維，逐步形成空洞類似于絲瓜瓤狀，成熟果肉全部變?yōu)榘导t色，味苦不能食用，被稱為“血瓤”或“倒瓤” [6]。

自2004年廈門出入境檢疫局從日本進(jìn)口的南瓜種子中檢測到CGMMV，此后在北京、海南和遼寧等地區(qū)發(fā)生了危害，農(nóng)業(yè)部在2006年發(fā)布公告將其確定為我國重要的檢疫性病毒[7-9]。監(jiān)測該病毒病害的發(fā)生、建立種子健康檢測、應(yīng)用健康種子是保護(hù)產(chǎn)業(yè)免受該病毒侵染和危害最根本的措施[10]。

寧夏回族自治區(qū)西瓜年播種面積70萬hm2以上，過去采用自根苗栽培，由于連作病害不斷加重，近幾年開始推廣嫁接栽培。而西瓜嫁接所利用的砧木葫蘆、南瓜和接穗西瓜易攜帶CGMMV，嫁接西瓜容易通過帶毒的砧木或接穗種子感染該病毒，因此，我國嫁接西瓜生產(chǎn)主要省份和地區(qū)均有該病害發(fā)生與分布[11]，對我國西瓜產(chǎn)業(yè)構(gòu)成重要威脅。隨著寧夏回族自治區(qū)嫁接栽培的應(yīng)用與推廣，黃瓜綠斑駁花葉病毒在該地區(qū)傳入與蔓延的風(fēng)險(xiǎn)也加大。

2018年監(jiān)測發(fā)現(xiàn)該地區(qū)發(fā)生了CGMMV，本文系該病毒在寧夏回族自治區(qū)發(fā)生的首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年7月27日在寧夏中衛(wèi)嫁接西瓜病毒病發(fā)生地選取3株癥狀明顯的西瓜植株，每株采病葉1份，分別標(biāo)記為NX1、NX2和NX3，用保鮮袋分別裝好帶回河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。菌種與載體：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10購買于北京博邁德公司，克隆載體PTOPO-Blunt購自艾德萊生物。

1.2 田間病害癥狀觀察

分別記載拍攝植株整體、葉片和西瓜果實(shí)的剖面。

1.3 檢測

采用ELISA和One Step RT-PCR方法。ELISA檢測：CGMMV檢測抗體購自北京艾康健動物疫苗技術(shù)有限公司，按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。One Step RT-PCR檢測：首先根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已有的CGMMV序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增部分運(yùn)動蛋白基因（MP）與整個外殼蛋白基因（CP）的特異性引物，5420F：5-TCCTTTGACTTTAGAGGTCG-3和3UTR：5-TGGGCCCCTACCCGGGGAA-3。對發(fā)病樣品（NX1、NX2和NX3）和健康植株進(jìn)行總RNA提取，之后以RNA為模板，參照TAKARA的One Step RT-PCR說明書進(jìn)行PCR檢測。其中，CGMMV檢測所用引物為5420F/3UTR，其PCR體系為：2×One Step Buffer（Dye Plus） 10 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 0.8 μL，5420F（10 μmol·L-1） 1 μL，3UTR（10 μmol·L-1） 1 μL，RNA 1 μL，RNase Free H2O 6.2 μL，總體積為 20 μL。PCR程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s;57 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存;PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 CP基因克隆與序列分析

CP基因克隆：利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）對3份樣品的總RNA（1μg）進(jìn)行隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，對反轉(zhuǎn)錄獲得的第1條鏈CDNA用5420F/3UTR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為1 004 bp，利用膠回收試劑盒（Axygen）回收目的片段并與其克隆載體PTOPO-Blunt載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆經(jīng)PCR初步鑒定后送樣測序。

序列分析：對試驗(yàn)中獲得的3份CGMMV寧夏分離物包含CP基因片段的序列，用Clustalx 1.83軟件進(jìn)行多序列比對分析;寧夏3份樣品與GenBank中已公布的CGMMV基因組序列用BLAST在線軟件進(jìn)行序列比對。運(yùn)用MEGA 7.0.26軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），選擇重復(fù)次數(shù)為1 000，以同屬的麻花葉病毒（Sunn-hemp mosaic virus，SHMV）的CP基因序列為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

發(fā)病西瓜植株出現(xiàn)全株性系統(tǒng)性葉片病變，葉片表現(xiàn)斑駁，沿葉片邊緣表現(xiàn)褪綠，部分出現(xiàn)黃化，葉片對光觀察更為明顯;果實(shí)切開出現(xiàn)倒瓤，種子周圍形成暈圈，果柄處產(chǎn)生褐色壞死斑（圖1）。

2.2 黃瓜綠斑駁花葉病毒的鑒定

用CGMMV的抗體做DAS-ELISA檢測，結(jié)果均為陽性（圖2）;用CGMMV的特異性引物進(jìn)行one step RT-PCR檢測，可擴(kuò)增獲得預(yù)期目的片段，大小為1 004 bp（圖3）。

2.3 CGMMV CP 基因序列分析

寧夏3份樣品分離物間CP 核苷酸序列相似性為100%;與已報(bào)道的序列比對，其CP核苷酸序列相似性為93%～99%，最多僅有8個堿基位點(diǎn)發(fā)生改變。選擇數(shù)據(jù)庫中來自不同國家和地區(qū)16條CGMMV分離物的CP基因序列與本研究中獲得的寧夏分離物中CP基因的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（表1，圖4），由此可確定寧夏分離物為黃瓜綠斑駁花葉病毒病原，而且CP基因的核苷酸序列不存在分子多樣性。

3 討 論

寧夏回族自治區(qū)的西瓜產(chǎn)業(yè)是我國西瓜產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，不僅栽培面積較大和集中，更以中衛(wèi)市的壓砂栽培方式而創(chuàng)造了奇跡，所生產(chǎn)的西瓜品質(zhì)優(yōu)良，供應(yīng)時間多集中在7月中下旬至8月，極大地彌補(bǔ)了該時間段華東地區(qū)西瓜供應(yīng)不足的局面，因而形成了寧夏西瓜產(chǎn)業(yè)的特色。

為解決重茬導(dǎo)致的種植地區(qū)病害加重的問題，寧夏地區(qū)幾年來開始推廣嫁接栽培方式，而目前的檢測表明，在西瓜嫁接的地區(qū)，黃瓜綠斑駁花葉病毒更易發(fā)生大暴發(fā)[11]。筆者首先對寧夏中衛(wèi)種植西瓜病害暴發(fā)地區(qū)進(jìn)行實(shí)地調(diào)研，通過對發(fā)病植株的整體、葉片以及果實(shí)剖面的觀察，初步鑒定出該地區(qū)病害大暴發(fā)是由CGMMV引起的，采集該地區(qū)發(fā)病瓜地的3份嫁接西瓜樣本，對其進(jìn)行ELISA檢測和一步法RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，2018年寧夏中衛(wèi)地區(qū)西瓜病毒病大暴發(fā)確由CGMMV引起。為了進(jìn)一步確定寧夏CGMMV的分類地位，筆者克隆了3份采集樣本分離物的CP基因，3個寧夏分離物的CP基因之間核苷酸序列一致性達(dá)到100%，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的大多數(shù)CGMMV分離物的核苷酸序列一致性高達(dá)99%，與俄羅斯的分離物的一致性最低，達(dá)93%，推測可能是由于地理來源不同導(dǎo)致的。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可以明確看到寧夏分離物（NX1）與安徽、河南、浙江和山東的分離物同源性最為相近，可能因?yàn)镃GMMV是通過種質(zhì)交流與遠(yuǎn)距離調(diào)運(yùn)，或者是通過帶毒的西瓜嫁接砧木傳播到寧夏中衛(wèi)地區(qū)，由此體現(xiàn)了加強(qiáng)從原種到繁育種子的檢疫的重要性[12]。

為了保障產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，監(jiān)測種傳病害尤其是瓜類細(xì)菌性果斑病（BFB）和CGMMV是最為重要的措施。通過對寧夏中衛(wèi)嫁接西瓜產(chǎn)區(qū)的CGMMV進(jìn)行實(shí)地調(diào)研、取樣分析，已經(jīng)證明田間倒瓤西瓜發(fā)生CGMMV，發(fā)生該病害的嫁接西瓜約200 hm2，系該地區(qū)關(guān)于CGMMV發(fā)生的首次報(bào)道。CGMMV是一種致病性強(qiáng)、傳播途徑廣并且防治極其困難的病毒，目前，選擇和種植抗病品種是防治CGMMV的有效途徑。其次，種植前應(yīng)結(jié)合該病毒的傳播方式從源頭預(yù)防其發(fā)生，應(yīng)選用健康的或者經(jīng)過嚴(yán)格消毒的種子或種苗，以及嚴(yán)格育苗管理的嫁接苗;采用輪作、及時清除田間病殘?bào)w和用熟石灰處理病田的方式來預(yù)防土壤傳播;為避免接觸傳播，在嫁接、修剪杈芽等栽培管理階段應(yīng)對手部和操作工具進(jìn)行消毒處理[11]。

一旦發(fā)生CGMMV，該地區(qū)就必須建立防御該病毒的系統(tǒng)工程：（1）集中處理病株、病瓜，晾干焚燒，減少對土壤的污染;（2）對全區(qū)生產(chǎn)采用的西瓜種子和砧木種子必須抽樣檢測，發(fā)現(xiàn)可能的風(fēng)險(xiǎn)源，應(yīng)該采用不帶毒的種子;（3）加強(qiáng)育苗的消毒處理;（4）生產(chǎn)區(qū)的全面監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)及早處理[5]。如何建立該系統(tǒng)工程，需要政府、企業(yè)、科研、農(nóng)戶等不同層面的參與、組織、協(xié)調(diào)、管理、執(zhí)行、監(jiān)測、處理等，方方面面配合才能夠完成。

致謝：感謝浙江大學(xué)宋鳳鳴教授、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心張超副研究員、寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心丁吉文研究員等一同田間調(diào)查！

參考文獻(xiàn)

[1] AINSWORTH G C.Mosaic disease of cucumber[J].Annals of Applied Biology，1935，22：55-67.

[2] OKADA Y.Cucumber green mottle mosaic virus[M]//The plant viruses.Springer，Boston，MA，1986：267-281.

[3] 李俊香，古勤生.黃瓜綠斑駁花葉病毒傳播方式的研究進(jìn)展[J]. 中國蔬菜，2015（1）：13.

[4] DOMBROVSKY A，TRAN-NGUYEN L T T，JONES R A C.Cucumber green mottle mosaic virus：rapidly increasing global distribution，etiology，epidemiology，and management[J].Annual Review of Phytopathology，2017，55：231-256.

[5] 古勤生.防治監(jiān)控黃瓜綠斑駁花葉病毒，確保瓜類安全生產(chǎn)[J].中國瓜菜，2007，20（1）：47-48.

[6] 蔡明，金學(xué)典.遼寧省西瓜倒瓤病的檢疫與防控措施[J].中國植保導(dǎo)刊，2013，33（3）：56-57.

[7] 王峰，任春梅，季英華，等.黃瓜綠斑駁花葉病毒海南分離物基因組測定與毒源分析[J].植物保護(hù)，2014，40（6）：75-81.

[8] 宋順華，吳萍，宮國義，等.黃瓜綠斑駁花葉病的發(fā)生及防控策略[J].植物保護(hù)，2014（8）：105-108.

[9] 周玲玲，吳元華，趙秀香，等.黃瓜綠斑駁花葉病毒生物學(xué)特性及對西瓜生長的影響[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（4）：417-422.

[10] 吳會杰，秦碧霞，陳紅運(yùn)，等.黃瓜綠斑駁花葉病毒西瓜、甜瓜種子的帶毒率和傳毒率[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（7）：1527-1532.

[11] 古勤生，彭斌，劉珊珊，等.我國嫁接西瓜黃瓜綠斑駁花葉病毒的防控對策[J].中國蔬菜，2013（11）：5-7.

[12] 李帥，單文書，馮明峰，等.來自安徽不同地區(qū)黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV） cp基因的分子進(jìn)化分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，43（4）：593-597.