劉 靜,張慧娟,王 飛,李 靜,韓青云,張榮波

(1.安徽理工大學醫(yī)學院,安徽 淮南 232001；2.河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心,河南 鄭州 450003)

血小板無力癥(Glanzmann thrombocytasthenia，GT)是最常見的血小板遺傳性疾病，ITGA2B和ITGB3純合或復合雜合基因突變導致血小板膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa缺陷引起血小板聚集異常[1]。該疾病由GLANZMANN E首次報道，主要臨床特征為血小板聚集缺陷、血栓收縮異常[2-4]，為常染色體隱性遺傳。然而，ITGA2B和ITGB3基因的雜合子突變可能表現為常染色體顯性遺傳的血小板型出血病16型 (platelet-type bleeding disorder-16，BDPLT16)[5]。BDPLT16臨床表現為先天性巨血小板減少癥，與血小板的大小不均有關，是一種血小板生成障礙，體外研究顯示有輕度血小板功能異常[6-8]。1960年，該病首先由CROSS描述了相近的臨床病癥[9-11]?；颊呖赡軟]有或僅有輕度增加的出血傾向，表現為出生后不久發(fā)病，為終生性的皮膚粘膜出血、淤血、鼻出血、貧血，女性則多見于經期大量出血，血小板不能自發(fā)響應多種誘導劑的聚集反應，包括ADP、膠原、腎上腺素等。

本研究對一例臨床疑為血小板無力癥但表現為常染色體顯性遺傳的家系患者進行基因突變分析，應用目標區(qū)域捕獲結合高通量測序技術，并通過Sanger測序驗證，明確病因和遺傳特征，為臨床醫(yī)生提供準確的診斷依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

先證者(III21)，男，31歲，自幼有出血傾向，多見于皮膚粘膜淤斑、牙齦出血、鼻出血、受傷后出血時間延長，長期嚴重貧血曾間斷輸血，臨床初步診斷懷疑為血小板無力癥。通過詢問疾病家族史，患者家族中還有其他類似出血癥狀患病成員，病情輕重不一，臨床信息和家系情況如表1和圖1所示。

表1 先證者家族臨床資料及基因檢測結果

表示先證者，表示男性，○表示女性；●、■表示患病圖1 家系圖和遺傳檢測結果

1.2 樣本采集與DNA提取

在征得患者及其親屬的同意下，采集先證者及其家族成員的外周血。通過基因組DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術公司)提取樣本DNA。本研究已經獲得安徽理工大學醫(yī)學院倫理委員會的批準。

1.3 目標區(qū)域捕獲測序和Sanger測序驗證

打斷DNA并制備文庫，通過核酸探針對目標基因編碼區(qū)和剪切區(qū)附近的DNA進行捕獲和富集，然后使用高通量測序平臺Illumina HiSeq 2500進行變異檢測。最后通過Sanger測序對先證者、父母及其他家系成員進一步驗證。

1.4 變異致病性分析

通過檢索dbSNP、1000genome、gnomMAD、ClinVar、OMIM等數據庫的相關信息以及國內外的文獻。

2 結果

2.1 臨床診斷與家系分析

結合先證者表型和臨床檢查結果，醫(yī)生初始診斷為常染色體隱性遺傳的血小板無力癥。然而分析家族史信息，疾病傳遞明顯表現為常染色體顯性遺傳(見圖1)，更可能為BDPLT16，待進一步明確診斷。

2.2 高通量測序與Sanger驗證

通過生物信息學分析和數據解讀，先證者ITGA2B基因檢出c.2267+1G>T(NM-000419.3)的雜合變異。Sanger測序結果表明，患者父親攜帶ITGA2B基因c.2267+1G>T的雜合變異，而母親的ITGA2B基因未檢出(見圖2)，家族其他成員的檢測結果也表明，變異與疾病緊密連鎖。

圖2 先證者及父母 ITGA2B基因c.2267+1位點Sanger測序結果

2.3 變異致病性分析

c.2267+1G>T為剪接donor位點第一位堿基由 G變?yōu)門。根據內含子剪切的GT-AG法則，該位點極度保守，變異極有可能導致內含子不能剪接或引起外顯子缺失，通常對蛋白功能影響很大。dbSNP、1000genomes、gnomMAD數據庫均無該位點的頻率信息。ITGA2B基因ClinVar數據庫中已報道的15個致病變異，其中3個為剪切突變(見圖3)。結合患者的臨床表型和變異與在家系中與疾病連鎖情況，C.2267+1G>T變異極可能為致病變異，患者疾病可明顯診斷為BDPLT16。

圖3 ITGA2B基因致病變異譜ITGA2B基因目前已報道15個導致血小板無力癥的致病變異。黑色箭頭標注為本研究首次發(fā)現的致病位點。

3 討論

BDPLT16是一種罕見的遺傳性出血疾病，臨床多見于終身性牙齦和皮膚粘膜組織出血，生化檢查表現為少量的血小板減少癥、巨血小板、血小板聚集減少但凝塊收縮正常。與GT的遺傳方式不同，BDPLT16表現為常染色體顯性遺傳，呈現出家族聚集性。Ghevaert等報道了英國一個家庭有5人患有BDPLT16[12]。日本報道了一個遺傳4代的家系，其中10人有輕度出血傾向，如鼻出血、皮膚粘膜瘀斑，患者血小板的GPIIb / IIIa復合物的表達降低[11]。

血小板糖蛋白GPIIb與GPIIIa形成GPⅡb/Ⅲa復合物，是纖維蛋白原受體，也是血小板聚集中重要一環(huán)，其功能異常將會阻礙血小板與纖維蛋白的結合進而干擾正常的止血機制。GPⅡb/Ⅲa復合物的正常合成需要各個亞基的穩(wěn)定構象以及二者相互作用才能形成復合物，任何亞基的異常都將影響GPⅡb/Ⅲa復合物的功能異常。

人類ITGA2B基因位于17號染色體q21-23的區(qū)域，基因全長17.2 Kb，包含30個外顯子[13-14]，編碼血小板糖蛋白GBIIb，其是血小板膜粘附蛋白受體復合物GPIIb / IIIa的α亞基，β亞基GPIIIa由ITGB3基因編碼。GPIIb / IIIa復合物屬于整聯蛋白類細胞粘附分子受體，其具有與α和β亞基共同的異二聚體結構。GPIIb / IIIa復合物通過纖維蛋白原的受體介導血小板聚集。異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結合蛋白Gα13直接結合整合素β3細胞質結構域，并且通過配體結合整合素IIb/β3以及GTP加載Gα13促進Gα13-整合素的相互作用。干擾Gα13表達或Gα13的豆蔻?；瘻p弱了蛋白激酶c-Src的活化并刺激了小鳥苷三磷酸酶RhoA，從而抑制細胞擴散，加速細胞回縮[15]。

ClinVar數據庫已報道ITGA2B基因目前有三個致病性剪接變異(c.1544+1G>A、c.2094+2T>C、c.2602-3C>G)。本研究中，先證者家系中檢出ITGA2B基因一個雜合子變異c.2267+1G>T，正常人群該變異頻率極低，ClinVar和HGMD數據庫及檢索相關文獻均未有報道，應為首次發(fā)現。該位點位于ITGA2B基因22號內含子，為剪接位點，可能導致缺乏GPIIb分子表達，進而造成患者血小板上嚴重缺乏GPIIb/IIIa而出現相關臨床癥狀。

BDPLT16表現為常染色體顯性遺傳，患者父母至少有一人攜帶致病基因，雜合ITGA2B基因突變即可引起B(yǎng)DPLT16?；颊咄ǔＥR床表型差異較大，與遺傳背景和環(huán)境密切相關。BDPLT16目前尚無有效的治愈方法，出血是主要的臨床癥狀，病情嚴重可通過輸入血制品進行治療[16]。除輸血外，患者應避免使用影響血小板功能的藥物，如阿司匹林(非甾體類抗炎藥)[17]。BDPLT16或GT患者在兒童早期和青春期使用鐵補充劑，以避免出血引起的缺鐵性貧血[18]。該類患者一般無法從臨床上直接診斷，需要借助基因檢測可明確病因。及早的確診和遺傳咨詢，有助于臨床治療和預防，進而減輕社會和家庭的經濟負擔。