俞發(fā)榮,李建軍,YU Xin ,連秀珍,謝明仁,*,李登樓,陳望軍,郭蘊(yùn)萱

1.甘肅政法學(xué)院 甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州730070

2.University of Southern California,Los Angeles 90033,USA

0 前言

隨著人們物質(zhì)文化生活水平的日益提高,噪聲污染對(duì)人類與生物界影響日趨嚴(yán)重[1]。噪聲信號(hào)激發(fā)并引起聽覺系統(tǒng)的興奮,通過杏仁核激發(fā)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA-軸) 釋放應(yīng)激激素[2],促進(jìn)去甲腎上腺素(NA)的合成釋放,較高濃度的NA 一方面使機(jī)體出現(xiàn)精神緊張和內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào),導(dǎo)致組織器官的損傷[3],另一方面激活去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)回收運(yùn)轉(zhuǎn)NA,加速NA 的合成。中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元受損時(shí),腦組織內(nèi)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( brain derived neurotrophic factor,BDNF) 和其高親和力受體-酪氨酸激酶受體 B(tyrosine kinase B,TrkB)水平發(fā)生變化,防止神經(jīng)元受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng),維持中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元生存及正常生理功能。為了進(jìn)一步探索引起腦組織損傷的噪聲強(qiáng)度和NA、Nat、BDNF、TrkB 水平的關(guān)系,尋找預(yù)防噪聲污染對(duì)組織損傷的干預(yù)措施和方法,用Wistar 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,給予國(guó)家規(guī)定的環(huán)境噪聲排放標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)的噪聲,觀察對(duì)腦組織中基因表達(dá)的影響,為環(huán)境治理和環(huán)境保護(hù)以及政府主管部門制定預(yù)防和控制噪聲污染措施提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠50 只,體重180—190 g,6周齡,雌雄各半。來源于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心【SCXK (甘)2015—0001】,實(shí)驗(yàn)在甘肅政法學(xué)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行【SYXK (甘)2015—0006】。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定,按3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的人文關(guān)懷(倫理委員會(huì)審批號(hào)碼:GZF—2017—006)。

1.1.2 試劑與儀器

去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(noradrenaline transporter,NAt)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)試劑盒,購于北京索寶生物科技有限公司;利血平(reserpine),廣東邦民制藥廠有限公司;UFX7103 AAW 音頻信號(hào)發(fā)生器,上海電子教學(xué)儀器廠;TES—1352S 低頻聲計(jì)儀,泰仕電子工業(yè)股份有限公司;MK3-酶標(biāo)儀,上海儀器有限公司;噪聲刺激盒自制[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

全部動(dòng)物在SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室IVC 飼育籠內(nèi)飼養(yǎng)(籠內(nèi)溫度23℃ ± 1 ,℃ 濕度55%),每籠2 只,自由飲水進(jìn)食,自然光照,適應(yīng)7 d。按抓鬮法將Wistar 大鼠分為5 組,每組10 只大鼠(雌雄各半)?？瞻讓?duì)照組:不給噪聲刺激,在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上灌胃蒸餾水10 mL·kg-1體重;噪聲污染組(分為30、60、80 dB 三個(gè)組):在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上灌胃蒸餾水10 mL·kg-1體重,每天15:30 開始,分別將各組大鼠放入自制的噪聲刺激盒給予相應(yīng)的噪聲刺激,每組每次30 min,每天1 次;干預(yù)組(利血平+80 dB):在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上按利血平半數(shù)致死量(LD50)的 1/100(用無菌水配制,20 mg·L-1),灌胃(20 mL·L-1體重),下午給予80 dB 的噪聲刺激。連續(xù)刺激15 d。實(shí)驗(yàn)第16 天,全部動(dòng)物用乙醚麻醉,無痛打開顱腔,取腦,放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.4)固定液固定24 h,參照大鼠腦立體定位圖譜[5],切取大腦前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex,PFC)、海馬(hippocampus,Hipp)組織各5 mg,研磨成勻漿,3000 r·min-1離心20 min,取上清用去甲腎上腺素(NA)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrkB)試劑盒測(cè)定其吸光度(OD)。分別以NA、NAt、BDNF 、TrkB 標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),吸光度(OD)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。分別將各組大鼠腦組織吸光度值代入直線回歸方程,計(jì)算出NA、NAt、BDNF、TrkB 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間差異采用單因素方差分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,噪聲污染對(duì)大鼠腦組織NA、NAt、BDNF、TrkB 水平的影響程度用百分比表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素(NA)水平的影響

NA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:Y=3.2×10-3x+1.34×10-2,R2=0.9989。分別將30、60、80 dB 組 腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)NA 水平比對(duì)照組分別升高了29.62%、76.96%、93.57%和15.29%、55.08%、70.13%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)NA 水平比對(duì)照組分別降低了46.71%和62.06%;(圖1)。

2.2 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)水平的影響

NAt 標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:Y=1.4 ×10-3x+ 1.69×10-2,R2=0.9993;分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)NAt 水平比對(duì)照組分別升高了22.87%、50.35%、94.65%和12.00%、31.76%、61.83%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)NAt 水平比對(duì)照組分別降低了33.66%和52.06%,(圖2)。

2.3 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平的影響

BDNF 標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:Y=1.0×10-3x+ 1.33×10-2,R2=0.9986;分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)BDNF 水平比對(duì)照組分別升高了24.87%、39.27%、67.41%和44.97%、80.81%、95.84%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)BDNF 水平比對(duì)照組分別升高了16.36%和14.34%,升高程度明顯低于噪聲污染組,(圖3)。

圖1 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素(NA)水平的影響 Figure1 Effect of reserpine on NA levels in brain tissue of noise-contaminated rats( note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group).

圖2 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)水平的影響 Figure2 Effect of reserpine on NAt levels in brain tissue of noise-contaminated rats(Note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.

圖3 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平的影響 Figure3 Effect of reserpine on BDNF levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note：*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

2.4 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平的影響

TrkB 標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:Y=1.1×10-3x+ 1.19×10-2,R2=0.9993。分別將30、60、80 dB 組腦組織吸光度(OD)代入方程,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)TrkB 水平比對(duì)照組分別升高了32.64%、59.95%、82.64%和31.02%、57.31%、80.23%;先給予利血平再給予80 dB 噪聲刺激,大鼠大腦前額葉皮質(zhì)(PFC)和海馬(Hipp)TrkB 水平比對(duì)照組分別升高了4.75%和10.52%,升高程度明顯低于噪聲污染組,(圖4)。

3 討論

圖4 利血平對(duì)噪聲污染大鼠腦組織酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平的影響 Figure4 Effect of reserpine on TrkB levels in brain tissue of noise-contaminated rats(note.*P＜0.05,**P＜0.01,vs thecontrol group.)

噪聲污染直接和間接影響著人們的身心健康和生活質(zhì)量[6],增加人們精神和心理壓力[7],引起人們,尤其是兒童睡眠障礙,睡眠不足會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌和代謝紊亂[8]。噪聲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響與噪聲強(qiáng)度呈劑量-依賴關(guān)系[9],噪音不僅導(dǎo)致聽力障礙[10],還能引起高血壓[11]、缺血性心臟病[12],導(dǎo)致人們情緒波動(dòng)、恐懼和精神疾病[13]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,65 dB(A)以上的噪聲可增加冠心病發(fā)病率[14]和患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[15],增加死亡率[16]。噪聲污染提高交感神經(jīng)興奮性,使血壓升高[17],當(dāng)噪聲水平為50 dB 時(shí),通過應(yīng)激反應(yīng)使腎上腺素和去甲腎上腺素水平升高,血管收縮導(dǎo)致血壓升高,增加心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)[18]。神經(jīng)生理學(xué)研究表明,腦內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞體通過纖維投射分布到下丘腦、海馬和額葉等腦區(qū)。給予大鼠單胺氧化酶抑制劑,提高了突觸間的去甲腎上腺素(NA)濃度,去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)的表達(dá)也隨之增加[19]。NAt 作為交感 神經(jīng)突觸前膜上的一種微量膜蛋白,其功能是將神經(jīng)元釋放的NA 再攝取回突觸前膜中,調(diào)控突觸間隙中的NA濃度,終止神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào),維持受體對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性。NAt 是交感神經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)的重要環(huán)節(jié),在維持正常心血管系統(tǒng)正常功能發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在噪聲的刺激下,去甲腎上腺素(NA)、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NAt)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrkB)水平均升高,與噪聲強(qiáng)度呈劑量-依賴關(guān)系。結(jié)果說明,隨著噪聲強(qiáng)度的增加,腦組織內(nèi)去甲腎上腺素升高,引起去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性增加,將去甲腎上腺素?cái)z取運(yùn)回突觸前膜,維持突觸間去甲腎上腺素正常水平;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B 水平升高,保護(hù)腦組織細(xì)胞免受噪聲損傷。當(dāng)給予利血平后,去甲腎上腺素水平明顯降低或耗竭。結(jié)果提示,去甲腎上腺素(NA)是噪聲污染引起腦組織器官損傷的體內(nèi)主要因素,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和酪氨酸激酶受體B 防止神經(jīng)元受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),利血平使去甲腎上腺素耗竭,保護(hù)組織器官免受噪聲污染的損傷。