朱銳，吳校林，周青，李彬，李宸宇

（襄陽市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科，湖北 襄陽 441021）

急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome,ACS）主要是不穩(wěn)定的冠狀動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生破裂，并伴發(fā)炎癥激活、血小板聚集及血栓形成導(dǎo)致血管完全或不完全閉塞而引起心肌缺血壞死的臨床綜合征[1]。斑塊和血液中的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及其分泌的炎癥因子密切影響著動脈粥樣硬化和ACS 的發(fā)生、發(fā)展[2]。Fractalkine 作為一種常見的炎癥趨化因子，可與白細(xì)胞表面的受體結(jié)合，觸發(fā)β2 整合素和黏附分子的表達(dá)和活化，參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)過程[3]。因此，筆者對ACS 患者血液中的Fractalkine、β2 整合素[（淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1（LFA-1）、CD11a/CD18 巨噬細(xì)胞分子1（CD11b/CD18,Mac-1）]、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）等指標(biāo)進(jìn)行檢測并探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2017年10月襄陽市中心醫(yī)院收治的86 例ACS 患者。其中，不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris,UA）32 例（UA 組），急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）54 例（AMI組），同時選取20 例冠狀動脈造影正?；颊撸ㄕ＝M）和28例穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris,SAP）患者（SAP 組）作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均行冠狀動脈造影檢查且診斷均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染性疾病、先天性心臟病、瓣膜性心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤及嚴(yán)重心腎功能不全。4 組患者年齡、性別、危險因素及服藥情況等具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測β2 整合素LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18）的表達(dá)。所有患者于入院后第2 天清晨空腹采肘靜脈血2 ml 置于含乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，混勻后取100μl 全血加入10μl 異硫氫酸熒光素標(biāo)記的鼠抗人CD11a 抗體（美國BD 公司）和10μl 藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）標(biāo)記的鼠抗人CD18 抗體（美國BD 公司）置于A 管中；100μl 全血加入10μl FITC標(biāo)記的鼠抗人CD11b 抗體（美國BD 公司）和10μl PE 標(biāo)記的鼠抗人CD18 抗體置于B 管中；C 管中加入100μl 全血和陰性對照抗體（美國BD 公司）。室溫孵育30 min，每管中加入1 ml 紅細(xì)胞裂解液混勻后避光反應(yīng)10 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入1 ml 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）洗滌2 次，沉淀的白細(xì)胞加入0.5 ml PBS 緩沖液后上機(jī)檢測。采用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）檢測10 000 個細(xì)胞，Cell Quest 軟件分析，結(jié)果以陽性細(xì)胞百分率表示。

1.2.2 血清Fractalkine 和ICAM-1 的檢測 抽取空腹靜脈血2 ml 置于無任何添加劑的采血管中，2 h 內(nèi)以2 000 r/min 離心10 min，取上層血清于環(huán)氧樹脂管中并保存在-70℃冰箱中備用。血清中Fractalkine 和ICAM-1 的水平采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，酶標(biāo)儀為瑞士Tecan 公司產(chǎn)品，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒（美國Elabscience 公司）說明書進(jìn)行并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 Western blotting 檢測 1 ml 靜脈血加入5 ml紅細(xì)胞裂解液混勻后避光反應(yīng)10 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入5 ml PBS 緩沖液洗滌2 次；再向沉淀的白細(xì)胞中加入1.5 ml 總蛋白提取液4℃下14 000 r/min 離心30 min，取上清保存?zhèn)溆?。?0μg蛋白樣品，SDS-PAGE 電泳，100 V 轉(zhuǎn)移約1 h，溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底端處附近即可停止電泳。再將蛋白電泳轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，放入封閉液中37℃封閉1 h；加入武漢博士德公司的抗黏著斑激酶 （focal adhesion kinase,FAK）抗體（1：500）和抗蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）抗體（1：500），4℃過夜，反復(fù)洗膜后，將膜與相應(yīng)的二抗孵育，室溫下輕搖1 h，洗膜后放入顯影液顯影，定影液定影，將膠片掃描得到照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較

4 組患者臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4 組患者住院期間均服用他汀類藥物和雙抗血小板藥物（阿司匹林加氯吡格雷或替格瑞洛）。見表1。

表1 4 組患者臨床資料比較

2.2 LFA-1、Mac-1 水平比較

4 組患者外周血白細(xì)胞中LFA-1（CD11a/CD18）、Mac-1（CD11b/CD18）陽性細(xì)胞百分率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AMI 組和UA組患者LFA-1、Mac-1 陽性細(xì)胞百分率高于SAP 組和正常組患者（P＜0.05），且AMI 組患者LFA-1 和Mac-1 陽性細(xì)胞百分率較UA 組患者更高（P＜0.05）。見表2。

表2 4 組患者LFA-1、Mac-1 水平比較 %

2.3 血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較

4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與SAP組患者相比，AMI 組和UA 組患者較SAP 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平升高（P＜0.05），且AMI組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平較其他3 組高（P＜0.05）。見表3。

2.4 外周血白細(xì)胞FAK、PKB 蛋白水平比較

正常組、SAP 組、UA 組及AMI 組患者外周血白細(xì)胞FAK 蛋白相對表達(dá)水平分別為（0.545±0.027）、（0.659±0.039）、（0.783±0.039）及（0.942±0.079），4 組患者外周血白細(xì)胞FAK 蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.497，P=0.002）；UA 組和AMI 組患者FAK 蛋白水平高于SAP 組患者（P＜0.05）。正常組、SAP 組、UA 組、AMI 組患者外周血白細(xì)胞PKB 蛋白相對表達(dá)水平分別為（0.584±0.011）、（0.620±0.016）、（0.758±0.030）及（0.853±0.044）。4 組患者外周血白細(xì)胞PKB 蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.431，P=0.000）；UA 組和AMI 組患者PKB 蛋白水平高于SAP 患者（P＜0.05）。正常組和SAP 組患者FAK 和PKB 蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、2。

表3 4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較 （±s）

表3 4 組患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比較 （±s）

組別 n Fractalkine/（ng/L） ICAM-1/（ng/ml）正常組 20 442.7±32.1 157.9±37.8 SAP 組 28 571.6±37.7 359.9±45.2 UA 組 32 683.4±49.6 438.34±48.6 AMI 組 54 873.1±55.4 530.3±60.1 F 值 83.334 53.072 P 值 0.000 0.000

圖1 4 組患者外周血白細(xì)胞FAK、PKB 蛋白的表達(dá)

圖2 4 組患者外周血白細(xì)胞FAK、PKB 蛋白水平比較 （±s）

3 討論

動脈粥樣硬化是一種血管慢性炎癥反應(yīng)性疾病。ACS 是動脈粥樣硬化的主要臨床表現(xiàn)，包括ST 段抬高型心肌梗死、非ST 段抬高型心肌梗死及UA[4]。ACS 通常是易損的粥樣硬化斑塊破裂或不穩(wěn)定引起相關(guān)的冠狀動脈部分或完全閉塞。易損斑塊中含有大量的炎癥細(xì)胞，斑塊破裂后將引起血管中的白細(xì)胞聚集、黏附、游走、侵蝕。炎癥細(xì)胞激活，合成和釋放趨化因子、生長因子等炎癥細(xì)胞因子，放大炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)白細(xì)胞β2 整合素與黏附分子結(jié)合、血小板聚集、血栓形成及血管平滑肌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管狹窄或閉塞[2，4-5]。因此，冠狀動脈局部或全身的炎癥反應(yīng)在急性心肌缺血事件中起著重要的作用。

整合素是一類廣泛存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的紐帶。其主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)胞之間的黏附，細(xì)胞遷移，參與止血、血管生成及胚胎形成等生理過程[6-7]。其中β2 整合素只表達(dá)于白細(xì)胞，也稱之白細(xì)胞整合素，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18） 是β2 整合素的兩個重要成員，其可與配體ICAM-1 結(jié)合，調(diào)節(jié)白細(xì)胞穩(wěn)定黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上，為白細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮提供條件，便于白細(xì)胞游走到炎癥部位并發(fā)揮致炎作用[8]。Fractalkine 也稱為CX3CL1，是趨化因子CX3C 亞家族的唯一成員，其受體CX3CR1 主要表達(dá)在T 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞上，介導(dǎo)Fractalkine 的趨化作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ractalkine/CX3CR1 信號通路參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)過程，主要起促炎癥反應(yīng)的作用[9]。Fractalkine 不僅可介導(dǎo)白細(xì)胞黏附和跨膜轉(zhuǎn)移過程促進(jìn)循環(huán)中白細(xì)胞游出；還誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α 表達(dá)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促使巨噬細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶降解粥樣硬化斑塊纖維組織中膠原蛋白，導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊出現(xiàn)潰瘍或破裂，誘發(fā)ACS[3，9]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，ACS 患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平和外周血白細(xì)胞中LFA-1、Mac-1 陽性細(xì)胞百分率高于冠狀動脈造影正常和穩(wěn)定型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）患者，提示Fractalkine、ICAM-1、LFA-1 及Mac-1 參與ACS 局部和全身的炎癥反應(yīng)并且相互作用，且AMI 時這些炎癥指標(biāo)最高，炎癥反應(yīng)最強(qiáng)，這與國外的研究結(jié)果一致。

既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)整合素與ICAM-1 等配體結(jié)合后，F(xiàn)AK 構(gòu)象改變，使Tyr397 自身磷酸化，Tyr397通過結(jié)合磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）的p85 亞基SH2 結(jié)構(gòu)域激活PI3K途徑。PKB為PI3K的下游信號，參與白細(xì)胞活化、心肌缺血再灌注、細(xì)胞增殖及凋亡等很多重要的生理過程[10-11]。筆者通過Western blotting 技術(shù)檢測外周血白細(xì)胞FAK、PKB 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACS 患者FAK、PKB 蛋白水平較冠狀動脈造影正常和穩(wěn)定型冠心病患者升高。這一系列研究結(jié)果表明，ACS 時外周循環(huán)中β2 整合素、FRACTALKINE 等趨化因子及黏附分子表達(dá)增加、水平增高，增加的Fractalkine與白細(xì)胞表面的受體結(jié)合后促進(jìn)β2 整合素LFA-1、Mac-1 及黏附分子ICAM-1 活化，激活FAK-PI3K/PKB 信號通路參與ACS 的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，隨著筆者對不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊和ACS 炎癥反應(yīng)機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識，有助于尋找ACS 新的治療靶點，為ACS 的防治提供新的方向。