王惠哲　鄧強　張有為　李淑菊　楊瑞環(huán)　曹明明

摘? ? 要：為了獲得抗黑星病黃瓜種質(zhì)，為分子設(shè)計育種提供抗源，利用與黃瓜抗黑星病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記CSWCTT02D對102份黃瓜種質(zhì)資源進行基因型分析。結(jié)果表明，黃瓜種質(zhì)間抗病基因的標(biāo)記基因型存在遺傳變異性，明確了102份種質(zhì)抗黑星病基因的標(biāo)記基因型，3份種質(zhì)存在抗病標(biāo)記（2.94%），1份種質(zhì)為雜合型（0.98%），98份種質(zhì)不存在抗病標(biāo)記（96.08%）;苗期人工接種鑒定有高度抗病種質(zhì)4份（3.92%），高度感病種質(zhì)98份（96.08%）。SSR分子檢測結(jié)果與苗期人工接種基本一致，有2份材料與人工接種鑒定結(jié)果不符?！?436（華南型）接種為感病，標(biāo)記為抗病;‘K92（華南型）接種為抗病，標(biāo)記為感病，符合率達(dá)98.04 %?？共〔牧线x擇應(yīng)以人工接種結(jié)果為依據(jù)，因此初步鑒定出4份抗黑星病種質(zhì)，分別為日本類型‘Q6和‘NINIA、華南型‘南9427和‘K92，病情指數(shù)均為0。該研究為華北型黃瓜抗黑星病品種的遺傳改良奠定了技術(shù)與種質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜; 黑星病; SSR鑒定; 抗病性

Identification of cucumber germplasm resistance to scab by SSR markers and artificial inoculation at seedling stage

WANG Huizhe， DENG Qiang， ZHANG Youwei， LI Shuju， YANG Ruihuan， CAO Mingming

（State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation / Tianjin Kernel Cucumber Research Institute， Tianjin 300192， China）

Abstract ： In order to obtain cucumber germplasm resistant to scab， provide resistance sources for molecular design breeding， and finally breeding resistant varieties to control cucumber scab. In this study，SSR marker CSWCTT02D linked to scab-resistance gene was used to identify the marker genotypes of 102 cucumber germplasm resources. The results showed genetic variation of marker genotypes exists among different germplasm and within same germplasm as well. The marker genotypes of 102 germplasm were confirmed， 3 germplasm had disease resistance marker （2.94%）， one germplasm was heterozygous （0.98%）， and 98 germplasm had no disease resistance marker （96.08%）. There were 4 highly resistant germplasm （3.92%） and 98 highly susceptible germplasm （96.08% ） identified by artificial inoculation at seedling stage. The results of SSR molecular detection were basically consistent with that of artificial inoculation at seedling stage， and 2 materials did not match the identification results of artificial inoculation. South ‘9436 was inoculated as susceptible and marked as resistant， ‘K92 was inoculated with disease resistance and marked as susceptible， with a coincidence rate of 98.04%. The selection of disease-resistant materials should be based on the results of artificial inoculation， so 4 resistant cucumber germplasm were preliminarily identified， namely ‘Q6， ‘Ninia， ‘Nan9427 and ‘K92， with disease indices of 0. This study laid technical and germplasm foundation for improving scab-resistance cucumber varieties of north China cucumber.

Key words： Cucumber; Cladosporium cucumerinum; SSR Markers， Disease resistance

黃瓜（Cucumis sativus L.）是一種世界性的重要蔬菜作物，在自然選擇和栽培馴化過程中，形成了豐富多樣的變異類型和地方品種。在黃瓜生產(chǎn)中，病害的發(fā)生越來越頻繁，防治越來越艱難。選育抗病品種是控制黃瓜病害的最有效途徑。

黃瓜黑星病[Cladosporium cucumerinum Ell. et Arth.]俗稱“流膠病”，也叫“瘡痂病”，是一種毀滅性病害。該病是我國保護地的重要病害之一，是一種低溫病害，在保護地容易流行成災(zāi)，全生育期都可發(fā)生 [1-3]。Bailey和Burgess[4]于1934年首次報道黃瓜對黑星病的抗性由一對顯性基因控制，并且至今沒有黑星病菌生理小種分化的報道。天津科潤黃瓜研究所張桂華等前期研究利用抗病和感病組合（Q6×Q12）的F2分離群體獲得1個與抗黑星病相關(guān)基因遺傳距離為4.83 cM的顯性AFLP標(biāo)記[5];后續(xù)又獲得1個共顯性SSR標(biāo)記CSWCTT02D [6]，位于第2染色體，與目標(biāo)基因的遺傳距離為3.1 cM。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院康厚祥等于2011年以抗病自交系9110Gt和感病自交系9930構(gòu)建的重組自交系、F2群體和回交群體為試材，也獲得了2號染色體的相關(guān)SSR標(biāo)記，并獲得兩個Indel標(biāo)記，遺傳距離分別為0.14、0.15 cM [7]。上述研究均表明黑星病抗性是由一個單顯性基因控制，均獲得了與抗黑星病相關(guān)基因緊密連鎖的標(biāo)記，但均未應(yīng)用于為種質(zhì)遺傳改良而篩選可靠的抗病基因供體。天津科潤黃瓜研究所前期獲得的SSR標(biāo)記CSWCTT02D為一共顯性標(biāo)記，以抗黑星病母本‘Q6和感黑星病父本‘F51及其F2代分離群體為試材開發(fā)獲得，其中抗病帶為246 bp，感病帶為256 bp。筆者利用該標(biāo)記對黃瓜主要種質(zhì)資源進行抗病基因型分析，并與人工接種鑒定結(jié)果相比較，篩選出攜帶抗黑星病基因的抗源供體，旨在為華北型抗黑星病黃瓜品種遺傳改良及抗病新品種選育奠定種質(zhì)與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年1月至2018年5月在天津科潤黃瓜研究所植物病理實驗室和分子檢測室完成。102份黃瓜材料均為天津科潤黃瓜研究所育種一室提供，材料名稱如表1。其中，華北型74份，日本類型12份，華南型15份，荷蘭型1份。黃瓜種子用0.1%升汞消毒10 min，清水沖洗干凈后45～50 ℃溫水浸種4～6 h后于30 ℃恒溫箱內(nèi)催芽，出芽后播于盛有滅菌蛭石的育苗盤內(nèi)，放置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)育苗。

引物由上海生工生物工程有限公司合成，DNA提取試劑盒、Taq PCR Mix等試劑購自天津百奧泰科技發(fā)展有限公司。SSR標(biāo)記CSWCTT02D 引物序列如下：

上游引物5'-CATCCTCATTCATGGCGGAGTGTG-3';

下游引物5'-GAATTTGTTAAAATTGTACATTAA-3'。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 供試品種各取5 株植株的葉片混合，采用CTAB法提取基因組DNA，并保存于冰箱- 20℃條件下備用。

1.2.2 SSR分析體系 PCR反應(yīng)體系[6]為20 μL，黃瓜基因組DNA 20 ng、引物各50 ng、2×Taq PCR Mix 10 μL，ddH2O補足;反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性300 s，94 ℃變性30 s，55～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，再72 ℃延伸350 s。擴增產(chǎn)物在5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測，條帶記錄和分析。

1.2.3 苗期人工接種鑒定方法 黃瓜黑星病菌采自遼寧沈陽發(fā)病黃瓜植株，分離純化保存。將保存在PDA斜面上的病菌在PDA平板上擴繁，加少量無菌水洗下孢子，然后將孢子懸浮液加到預(yù)先鋪好的PDA平面上，涂勻，于20 ℃溫箱中培養(yǎng)7 d左右。無菌水洗下孢子后用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，使孢子分散于水中，血球計?shù)板計數(shù)后配成濃度為106·mL-1的懸浮液待用。黃瓜幼苗在人工培養(yǎng)箱中進行育苗，于第1真葉展開后，將幼苗放置于所內(nèi)植保實驗室。用手持噴霧器將孢子懸浮液均勻噴于葉面，以霧滴布滿葉面但不流失為宜。空調(diào)控溫，接種溫度為20 ℃左右，接種后保濕24 h，以后夜間適當(dāng)保濕。因黑星病抗病和感病發(fā)病癥狀為極端表現(xiàn)，102份黃瓜材料均為純合自交系，所以試驗中每材料只用10株即可代表其抗病性，于接種后5～7 d調(diào)查病情指數(shù)[7-13]。

1.2.4 抗性評價指標(biāo) 按病情指數(shù)（DI）劃分，高抗（HR）為0

病情指數(shù)（DI）=100×∑（各級植株數(shù)×級別值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級別值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種質(zhì)間黑星病標(biāo)記位點的遺傳變異性

利用與黃瓜抗黑星病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記CSWCTT02D的引物，對102份黃瓜種質(zhì)資源的基因組DNA進行了PCR擴增，結(jié)果如圖1所示。從圖1看出，該標(biāo)記在種質(zhì)資源間存在多態(tài)性，說明該標(biāo)記存在鑒定抗黑星病種質(zhì)的可能性。

對該引物擴增102份種質(zhì)的多態(tài)性條帶進行統(tǒng)計，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，黃瓜抗黑星病基因或者感黑星病基因的標(biāo)記位點在102份種質(zhì)間存在變異性。對于抗黑星病基因的標(biāo)記基因型，可望利用標(biāo)記輔助育種選擇技術(shù)鑒定抗病種質(zhì)，并以抗病種質(zhì)為供體進行黃瓜核心種質(zhì)的抗黑星病遺傳改良。

通過對102份種質(zhì)資源的標(biāo)記基因型分析，初步鑒定出抗性材料3份，中抗材料1份，感病材料98份。

2.2 種質(zhì)的苗期人工接種抗病性鑒定

采用苗期人工噴霧接種鑒定對102份黃瓜高代自交系進行黑星病抗性鑒定。獲得高度抗病材料4份， 華南型2份為‘南9427‘K92，日本類型2份為‘Q6和‘NINIA，共占3.92%;感病材料98份，占96.08%。該結(jié)果表明，我國黃瓜種質(zhì)資源中蘊藏著改良黑星病抗性的有價值基因資源，但抗源較少，而華北有刺類型種質(zhì)中無抗病材料。

2.3 2種方法結(jié)果比較

對這102份材料的人工接種鑒定和SSR分子檢測結(jié)果進行了符合性測定，有2份材料明顯不符，‘南9436（華南型）這個材料接種為感病，標(biāo)記為抗病，‘K92（華南型）接種為抗病，標(biāo)記為感病，由此計算2者符合率為98.04%，說明該分子標(biāo)記檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于黃瓜抗黑星病輔助育種（表1）。

3 討論與結(jié)論

通過對供試的102份黃瓜種質(zhì)的抗病性鑒定，明確了不同類型黃瓜品系的抗病性差異。其中，‘Q6（日本類型）、‘南9427（華南型）和‘NINIA（日本類型）這3份材料人工接種鑒定病情指數(shù)為0，高度抗病，SSR標(biāo)記檢測‘Q6和‘南9427為抗病，‘NINIA為雜合型。眾多研究均表明，黃瓜對黑星病的抗性由一對顯性基因控制，位于黃瓜chr2上[4-7]，因此，基因型為雜合的材料接種鑒定會表現(xiàn)為抗病，‘NINIA是抗病材料。在育種實踐中，如果培育抗黑星病品種，親本中有一個抗病則該品種就會抗病。

目前市場上的黃瓜主栽品種是華北有刺類型，但華北有刺類型黃瓜中幾乎沒有抗源，生產(chǎn)上主栽品種不抗黑星病;而日本類型、華南型材料中蘊藏著改良黑星病抗性的有價值基因資源。該研究為華北型黃瓜抗黑星病遺傳改良提供了材料基礎(chǔ)。采用回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合分子標(biāo)記檢測技術(shù)定向改良核心種質(zhì)的抗病性，聚合優(yōu)勢基因，是創(chuàng)新育種材料的快速、簡便、行之有效的關(guān)鍵手段。實際上，很多科研單位基礎(chǔ)研究和常規(guī)育種均取得不錯的成績，但基礎(chǔ)技術(shù)研究和育種實踐應(yīng)用兩者嚴(yán)重脫節(jié)，育種家大多不研究植物病理和分子標(biāo)記，植物病理研究人員又對育種不太在行，分子領(lǐng)域的人才也多對育種不是深入了解、甚至可能植物病理方面也不專業(yè)，在做試驗前基本是請別人給做接種鑒定，三者合一都很在行的人確實少之又少，因此很難取得較大進展[14-16]。目前，筆者已率先開展對黃瓜核心種質(zhì)資源進行抗黑星病基因的定向遺傳改良研究，以期培育優(yōu)質(zhì)、多抗黃瓜新品種，并創(chuàng)造黃瓜抗病新種質(zhì)。

上述結(jié)果表明，分子標(biāo)記檢測與苗期人工接種鑒定有偏差，符合率達(dá)到98.04%，標(biāo)記并非百分百準(zhǔn)確。一方面，標(biāo)記在開發(fā)過程中受到標(biāo)記密度、群體大小、人工接種鑒定、材料等多種因素的影響，導(dǎo)致與抗病基因的遺傳連鎖距離較大。因此，如果在育種材料的選擇過程中僅依賴一個標(biāo)記，可能會出現(xiàn)目標(biāo)偏離，在應(yīng)用中可使用雙標(biāo)記、多標(biāo)記或基因內(nèi)的標(biāo)記進行檢測。周倩[17]利用高密度遺傳圖譜和RIL群體中豐富的表型數(shù)據(jù)，將黃瓜抗黑星病基因Ccu縮小到88 kb 的區(qū)間，只含有一個抗病基因Csa2G021710，可作為Ccu 的候選基因。目前，本單位正在基因Csa2G021710內(nèi)部和標(biāo)記CSWCTT02D附近開發(fā)距離抗黑星病基因更近的SNP或Indel標(biāo)記，以便在進行種質(zhì)抗性遺傳改良及分子設(shè)計育種的應(yīng)用中，有效提高鑒定、篩選效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

參考文獻

[1] 易齊，王蔚，王傳英.黃瓜黑星病及其蔓延危害現(xiàn)狀[J].植物保護，1987（6）：40-41.

[2] 王進揚，盧香春，王敏.黃瓜黑星病調(diào)查簡報[J].中國蔬菜，1988（2）：42-43.

[3] 李明遠(yuǎn)，易齊.黃瓜黑星病在我國流行的現(xiàn)狀[J].長江蔬菜，1989（3）：26-27.

[4] BAILEY R M，BURGESS I M.Breeding Cucumbers resistant to scab.[J].Proceedings American Society for Horticultural Science，1934，32：474-476.

[5] 張桂華，韓毅科，孫小紅，等.與黃瓜抗黃瓜黑星病基因連鎖的分子標(biāo)記研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（11）：2250-2254.

[6] 王惠哲，李淑菊，管煒.與黃瓜抗黑星病相關(guān)基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記[J].分子植物育種，2009，7（3）：550-554.

[7] KANG H X，WENG Y Q，YANG Y H，et al.Fine genetic mapping localizes cucumber scab resistance gene Ccu into an R gene cluster[J].Theoretical Applied Genetics， 2011，122：795-803.

[8] 王惠哲，李淑菊，楊瑞環(huán)，等.黃瓜枯萎病、炭疽病、褐斑病、黑星病苗期抗源材料篩選試驗[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2013（8）：118-121.

[9] 王惠哲，管煒，楊瑞環(huán)，等.黃瓜種質(zhì)資源抗黑星病鑒定與評價[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2013（12）：135-137.

[10] ABUL-HAYJA Z，WILLIAMS P H.Inheritance of two seedling markers in cucumber[J].HortScience，1976，11（2）：145.

[11] 李光，李淑菊，王惠哲.兼抗黃瓜枯萎病、角斑病和黑星病育種材料苗期篩選[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，13（3）：23-25.

[12] 王艷飛，李平，王惠哲.黃瓜枯萎病、白粉病、霜霉病和黑星病苗期多抗性鑒定方法的評價[J].中國蔬菜，2007（3）：27-28.

[13] 王惠哲，李淑菊.黃瓜枯萎病-白粉病-褐斑病-黑星病多抗性鑒定技術(shù)研究[J].中國瓜菜，2010，23（5）：6-8.

[14] 李全輝，李錫香，王海平，等.黃瓜抗黑星病相關(guān)基因的差異表達(dá)分析[J].植物遺傳資源學(xué)報，2013，14（3）：501-506.

[15] 毛愛軍，張峰，張麗蓉，等.黃瓜品系WIS2757對黃瓜枯萎病生理小種4和黑星病的抗性遺傳與連鎖分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）：3382-3388.

[16] 康厚祥.黃瓜抗黑星病基因Ccu的精細(xì)定位與圖位克隆及黃瓜與黑星菌互作的表達(dá)譜分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[17] 周倩.基于基因組測序的黃瓜高密度遺傳圖譜構(gòu)建和果皮淺綠突變體基因定位[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015.