范波　施莉

[摘要] 目的 研究MicroRNA-27a靶向PHLPP2促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的機制。 方法 選取我院2016年1月～2018年1月收治的胃癌患者60例，提取所有患者的胃癌組織和胃癌旁組織，研究MicroRNA-27a靶向PHLPP2促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的機制。 結(jié)果 在SGC-7901細胞中，miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染后可能會引起報告載體熒光素酶活性的上升，但是在miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染之后，熒光素酶的活性并沒有發(fā)生較大變化。在AGS細胞中，miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染可能會引起報告載體熒光素酶活性的下降，但是在miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染的報告載體中，熒光素酶的活性并沒有發(fā)生較為顯著的變化。轉(zhuǎn)染miRa antagomir后，SGC-7901細胞中PHLPP2中的mRNA水平和蛋白水平明顯上升，轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a agomir后，AGS細胞中的PHLPP2的mRNA水平和蛋白水平明顯下降（P均<0.05）。 結(jié)論 miR-327a在胃癌組織和胃癌細胞系中表達上調(diào)，MicroRNA-27a能夠在胃癌細胞中對PHLPP2的活性產(chǎn)生抑制作用，并且能夠促進胃癌細胞的凋亡，對胃癌患者的治療能夠產(chǎn)生一定的積極作用。

[關鍵詞] MicroRNA-27a;靶向PHLPP2;胃癌細胞;增殖;轉(zhuǎn)移;機制

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）11-0001-04

Mechanism of MicroRNA-27a targeting PHLPP2 promoting proliferation and metastasis of gastric cancer cells

FAN Bo1? ?SHI Li2

1.Department of Clinical Laboratory， Jinhua People's Hospital in Zhejiang Province， Jinhua? ?321000， China; 2.Department of Gastroenterology， Jinhua People's Hospital in Zhejiang Province， Jinhua? ?321000， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of MicroRNA-27a targeting PHLPP2 promoting proliferation and metastasis of gastric cancer cells. Methods Sixty patients with gastric cancer admitted to our hospital from January 2016 to January 2018 were enrolled. The gastric cancer tissues and paracancerous tissues of all patients were extracted to study the mechanism of MicroRNA-27a targeting PHLPP2 to promote the proliferation and metastasis of gastric cancer cells. Results In SGC-7901 cells， co-transfection of miR-27a antagomir and vector-3'UTR-wt may cause an increase in luciferase activity in the reporter vector， but after co-transfection of miR-27a antagomir and vector-3'UTR-wt， there was no significant change in the activity of luciferase. In AGS cells， co-transfection of miR-27a antagomir and vector-3'UTR-wt may cause a decrease in luciferase activity in the reporter vector， but also no significant change was observed after co-transfection. After transfection of miRa antagomir， the mRNA level and protein level of PHLPP2 in SGC-7901 cells increased significantly. After transfection of MicroRNA-27a agomir， the mRNA and protein levels of PHLPP2 in AGS cells decreased significantly（P<0.05）. Conclusion The expression of miR-327a is up-regulated in gastric cancer tissues and gastric cancer cell lines. MicroRNA-27a can inhibit the activity of PHLPP2 in gastric cancer cells and promote the apoptosis of gastric cancer cells， which has positive effects on the treatment of gastric cancer.

[Key words] MicroRNA-27a; Targeting PHLPP2; Gastric cancer cells; Proliferation; Metastasis; Mechanism

胃癌是臨床上較為常見的一種惡性腫瘤類型，發(fā)病率和致死率均非常高，隨著醫(yī)學科技的不斷發(fā)展完善，臨床上對胃癌的防治取得了一定的成效，患者的生存率有所提升，但是胃癌患者的遠期生存期仍處于較低水平，仍然需要不斷地研究和探索，尋找更加合理的胃癌治療方式[1，2]。MicroRNA屬于分子長度為18～24的核糖核苷酸，MicroRNA調(diào)控著人體中大約30%的蛋白質(zhì)編碼基因表達，MicroRNA-27a位于人類第19號染色體。MicroRNA-27a在多種腫瘤組織中均會出現(xiàn)異常表達，并且在不同的腫瘤組織中，MicroRNA-27a的表達也不相同。PHLPP指的是PH結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復蛋白磷酸酶蛋白，PHLPP2屬于PHLPP家族的重要成員，由1323個氨基酸構(gòu)成，位于16q22.3。有研究發(fā)現(xiàn)[3-6]，PHLPP2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。由于microRNA能夠通過調(diào)控原癌基因和抑癌基因在腫瘤發(fā)展過程中的表達，所以人們通常將microRNA和PHLPP聯(lián)系起來，研究MicroRNA-27a靶向PHLPP2促進胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的機制對于腫瘤的治療意義重大。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取我院2016年1月～2018年1月收治的胃癌患者60例，男31例，女29例，年齡45～78歲，平均（60.8±1.9）歲，所有患者均經(jīng)臨床檢查和病理學診斷確診為胃癌，提取所有胃癌患者的胃癌細胞組織和胃癌旁組織，為保證檢測結(jié)果的準確性，本次研究排除了在術(shù)前接受過放療、化療以及其他腫瘤相關治療的患者，所有患者均自愿接受本次研究，并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

本次實驗所用試劑包括TransScriptRRT/RI Enzyme Mix、RNAiso Plus、Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR Primer kit、hsa-MicroRNA-27a檢測引物、hsa-U6檢測引物、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），本次實驗所用儀器包括組織勻漿器、精密電子天平、低溫高速離心機、熒光實時定量PCR儀、恒溫水浴鍋以及Epoch超微量微孔板分光光度計等。

1.3方法

切取所有患者的胃癌組織和癌旁組織，在對患者的胃癌旁組織進行切取時，為了保證與患者胃癌組織明確區(qū)分，正常組織需距離患者胃癌邊緣5 cm以上，標本切取完成后，將切取的組織放置于凍存管中進行存放備用，剩余組織使用福爾馬林浸泡。

利用Real-time PCR方式對60例胃癌患者的胃癌組織和癌旁正常組織的MicroRNA-27a表達水平進行檢測，比較胃癌組織和癌旁正常組織中MicroRNA-27a表達的差異。按照RNAiso Plus的說明書對胃癌組織和癌旁正常組織的總RNA進行提取，首先取出胃癌組織和癌旁正常組織各50 mg，然后在樣本中分別加入1 mL的RNAiso Plus混合，隨后置入組織勻漿器，設置成60 Hz，進行時長為4 min的勻漿操作，室溫條件下放置5 min，將EP管放入離心機中以12000 rpm的速度離心4 min，取上清放入去Rnase的EP管中，加入200 μL的氯仿，將EP蓋蓋緊，搖晃均勻在室溫下放置5 min，在4℃條件下以12000 rpm的速度離心15 min，從離心機中平穩(wěn)取出EP管，將上層水相轉(zhuǎn)移到新的去Rnase的EP中，加入相同體積的異丙醇，混合均勻后加入適量的無RNA酶水溶解RNA沉淀，溶解后使用超微量微孔板分光光度計測定溶液的濃度和純度。使用Bulge-LoopTMmiRNAqRT-PCR Primer kit進行miRNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄反應，反應結(jié)束后導出各孔樣本的Ct值，對基因差異表達水平進行定量分析。

使用TargetScan、MiRDB、StarBase等MiRNSA靶基因預測MicroRNA-27a與PHLPP2結(jié)合的可能位點。將含有與MicroRNA-27a可能結(jié)合位點的PHLPP2片段連接在pGL3-3UTR載體上，利用檢測熒光值的方式對MicroRNA-27a與PHLPP2的結(jié)合情況進行檢測。采取Western Blot方式對胃癌細胞中MicroRNA-27a低表達后的PHLLPP2蛋白表達水平進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS21.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用Student's two-tailed t-test校驗，所有的實驗結(jié)果最少要重復3次以上，所有的計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗或方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA-27a與PHLPP2的結(jié)合位點

使用TargetScan、MiRDB、StarBase等MiRNSA靶基因預測MicroRNA-27a與PHLPP2結(jié)合的可能位點;結(jié)果見表1。在SGC-7901細胞中，miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染后可能會引起報告載體熒光素酶活性的上升，但是在miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶的活性并沒有發(fā)生較大變化。在AGS細胞中，miR-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染后，從報告上看，載體熒光素酶的活性出現(xiàn)下降，但熒光素酶的活性并沒有發(fā)生較為顯著的變化。在AGS細胞中，MicroRNA-27a antagomir與vector-3'UTR-wt共轉(zhuǎn)染的報告載體中，熒光素酶的活性并沒有發(fā)生較為顯著的變化，說明在胃癌細胞中，MicroRNA-27a能夠靶向結(jié)合PHLPP2的3'UTR區(qū)，利用這種方式達到對PHLPP2表達進行調(diào)控的目的。

2.2 轉(zhuǎn)染前后mRNA水平和蛋白水平比較

將MicroRNA-27a antagomir或者MicroRNA-27a agomir轉(zhuǎn)染到胃癌細胞SGC-7901或胃癌細胞AGS中，將MicroRNA-27a的水平進行下調(diào)或者上調(diào)后，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRa antagomir之前，患者的SGC-7901細胞中PHLPP2的mRNA水平和蛋白水平分別為（1.21±0.01）、（1.26±0.01），轉(zhuǎn)染miRa antagomir后mRNA水平和蛋白水平分別上升為（1.73±0.01）、（1.78±0.01），兩組比較差異顯著（P均<0.05）;轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a agomir前，AGS細胞中的PHLPP2的mRNA水平和蛋白水平為（2.64±0.01）、（2.59±0.01），轉(zhuǎn)染MicroRNA-27a agomir后，AGS細胞中的PHLPP2的mRNA水平和蛋白水平下降為（1.72±0.01）、（1.64±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。見表2。

表2? ?轉(zhuǎn)染前后mRNA水平和蛋白水平比較（x±s，mmol/L）

2.3 miR-27a 在胃癌系中的表達

各個胃癌細胞系中的各指標均出現(xiàn)不同程度的miR-27a的高表達，其中MGC-803、AGS、SGC-7901與人正常胃黏膜細胞 GES-1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），胃癌細胞系BGC-823與人正常胃黏膜細胞GES-1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

通過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-27a在胃癌中能夠起到促癌基因的作用，一般來說，miRNA通常只有通過靶基因才能夠發(fā)揮作用，為了對MicroRNA-27a在胃癌中發(fā)揮促癌作用的機制進行更加深入的研究，選擇TargetScan、MiRDB和AtarBase V2.0等miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫對MicroRNA-27a的靶基因和結(jié)合位點進行預測。

PHLPP指的是PH結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復蛋白磷酸酶蛋白，PHLPP2屬于PHLPP家族的重要成員，由1323個氨基酸構(gòu)成，位于16q22.3。PHLPP2在人體中的分布非常廣泛，并且對于大部分細胞能夠產(chǎn)生較大的作用，比如PHLPP2能夠通過負向調(diào)解Akt、Mst1、PKC、MARK激活的信號通路，對人體各組織的功能產(chǎn)生調(diào)解作用，并且PHLPP2對于人體中細胞的增殖、生長、凋亡等也能夠產(chǎn)生很大的影響。有研究發(fā)現(xiàn)[7-12]，PHLPP是一種非常重要的抑癌基因類型，在癌癥治療方面能夠發(fā)揮巨大的價值，如果人體中出現(xiàn)PHLPP表達的下調(diào)或者缺失，會對人體健康產(chǎn)生一定的不良影響。在PHLPP家族中，不僅包含PHLPP2，還包含PHLPP1α、和PHLPP1β等，其中以PHLPP2的表達最為活躍，一旦受到某種因素的刺激，PHLPP2很容易發(fā)生基因損傷或者突變。此外，PHLPP2還能夠直接去磷酸化Akt Ser473，導致Akt Ser473失去活性，這種反應能夠起到抑制PI3k/Akt信號通路的效果，在細胞存活方面影響非常大。

許多研究中均發(fā)現(xiàn)[13-16]，MicroRNA-27a在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用。在本次研究中也發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞中的MicroRNA-27a比例下降時，p-Akt以及CyclinD1的表達也會出現(xiàn)下降，而p21和p27則會出現(xiàn)上升，在敲減PHLPP2單位情況下能夠抵抗上述變化，這說明PHLPP2/Akt能夠參與到MicroRNA-27a調(diào)控胃癌細胞的增殖過程中。MicroRNA-27a的高表達與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移也具有較大的關系，在檢測了E-cadherin、p-GSK3β、Vimentin和Snail的蛋白水平后，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)MicroRNA-27a的水平后，可能對Akt/GSK-3β通路造成了影響，從而使胃癌細胞EMT出現(xiàn)了明顯的抑制作用[17-20]。提示MicroRNA-27a能夠通過抑制PHLPP2的表達對Akt通路進行調(diào)節(jié)，達到在胃癌細胞中的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-27a在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達上調(diào)，MicroRNA-27a能夠在胃癌細胞中對PHLPP2的活性產(chǎn)生抑制作用，并且能夠促進胃癌細胞的凋亡，對胃癌患者的治療能夠產(chǎn)生一定的積極作用。

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