傅昱 李燕霞 劉婉蓉

摘要 為明確引起崗梅Ilex asprella枝枯病的病原，對(duì)從廣東梅州采集的崗梅枝枯病病部分離的致病菌株Gangmei 2進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，并運(yùn)用MEGAX構(gòu)建了病原菌株rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：病原菌的形態(tài)學(xué)特征與擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌相似，在系統(tǒng)發(fā)育樹中該菌株與小孢擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis microspora在同一分支上。因此，初步將崗梅枝枯病病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢菌P.microspora。

關(guān)鍵詞 崗梅; 枝枯病; 病原鑒定; 小孢擬盤多毛孢菌

中圖分類號(hào)： S 432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018268

Abstract The pathogen causing branch blight of Ilex asprella was identified by Kochs postulates， morphological characteristics and phylogeny analysis of rDNA internal transcribed spacer （ITS）. The results showed that the pathogenic isolate Gangmei 2 from diseased I.asprella samples from Meizhou， Guangdong province was similar to Pestalotiopsis fungus in morphological characteristics. The isolate Gangmei 2 was in the same clade with Pestalotiopsis microspora by construction of phylogenetic tree between the isolate and the related isolates from GenBank.Therefore， the pathogen that causing branch blight of I.asprella was preliminarily identified as P.microspora.

Key words Ilex asprella; branch blight; identification of the pathogen; Pestalotiopsis microspora

崗梅Ilex asprella （Hook. et Arn.） Champ. ex Benth.屬冬青科冬青屬Ilex L.，分布于廣東、廣西等地[1]，是我國南方民用中藥，具有清熱解毒、生津止渴、利咽消腫、散瘀止痛之功效，臨床用于治療感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽、熱病津傷口渴、咽喉腫痛、跌打瘀痛等病癥[2]。

崗梅的藥用價(jià)值之廣使其市場(chǎng)需求量越來越大，崗梅的栽培面積也隨之?dāng)U大。枝枯病是崗梅大面積種植過程中的一種主要病害，株發(fā)病率為10%以上。崗梅枝枯病主要危害崗梅的主干、側(cè)枝和嫩梢，引起發(fā)病枝條萎蔫、干枯，樹勢(shì)衰弱，生長(zhǎng)速度緩慢，崗梅的產(chǎn)量和品質(zhì)下降。關(guān)于崗梅枝枯病病原的報(bào)道，袁勤峰等[3]認(rèn)為引起廣東崗梅枝枯病的病原菌是膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides complex，何凌冰等[4]則認(rèn)為該病由葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起，但是否存在其他病原菌引起廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣崗梅生產(chǎn)基地上的崗梅枝枯病，并不清楚。因此，本研究對(duì)崗梅枝枯病病原菌進(jìn)行鑒定，旨在對(duì)該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：供試健康崗梅植株株高約40 cm，由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供;罹病崗梅樣本于2016年10月采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣的華潤三九醫(yī)藥股份有限公司中藥材種植基地。

培養(yǎng)基：PDA，參照《植病研究方法》[5]配方配制。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化與致病性測(cè)定

采用常規(guī)組織分離法對(duì)田間采回的罹病崗梅樣本進(jìn)行分離，將獲得的培養(yǎng)物在顯微鏡下用無菌接種針挑取單菌絲片段進(jìn)行兩次菌株純化，獲得純培養(yǎng)分離物。致病性測(cè)定采用針刺法在無病健康且長(zhǎng)勢(shì)相近的崗梅幼苗莖部進(jìn)行。將純化后的菌株在PDA平板上28℃培養(yǎng)3～4 d后取直徑1 cm的菌絲塊貼住針刺部位，并用濕潤的棉花覆蓋固定，對(duì)照組接種直徑1 cm的無菌PDA培養(yǎng)基，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。于28℃光照條件下保濕培養(yǎng)5～10 d后，觀察分離物的致病情況。對(duì)接種后發(fā)病的組織再次進(jìn)行病原菌分離純化，比較該分離物與接種病原菌的形態(tài)異同。

1.2.2 病原菌的形態(tài)觀察

將4℃斜面保存的菌株轉(zhuǎn)至PDA平板上，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，觀察并記錄菌落特征，每日測(cè)定菌落大小。待菌落產(chǎn)孢后利用鏡臺(tái)及目鏡測(cè)微尺測(cè)定分生孢子的大小，記錄并統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 病原菌的分子鑒定

采用Chi等[6]的方法提取病原真菌總基因組DNA，對(duì)rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增所用的引物為ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）[7]。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL、DNA模板5 μL、5 μmol/L ITS1和ITS4各1 μL、Nucleasefree Water 5.5 μL;PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)熱3 min;94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃再延伸7 min;4℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，最后將目標(biāo)片段送往華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并運(yùn)用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 崗梅枝枯病的癥狀特點(diǎn)及病原菌致病性測(cè)定

崗梅枝枯病主要危害崗梅的主干、側(cè)枝和嫩梢，引起發(fā)病枝條萎蔫、干枯，樹勢(shì)衰弱，生長(zhǎng)緩慢。嫩梢發(fā)病時(shí)枝條由綠色變?yōu)樯詈稚?，嫩葉和幼莖失水，干枯（圖1a～b）。主干和側(cè)枝初侵染時(shí)，病斑處失綠變褐，呈條狀，病斑中心呈現(xiàn)出黑褐色的斑塊，病斑周圍淺褐色，病斑逐漸擴(kuò)散侵染，后整個(gè)病斑成為黑褐色，嚴(yán)重時(shí)病斑環(huán)繞大部分主莖，導(dǎo)致病斑以上部位因養(yǎng)分輸送受阻而失水失綠干枯。

從病組織上獲得3個(gè)分離物：Gangmei 1、Gangmei 2和Gangmei 3。利用針刺法對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果顯示，只有分離物Gangmei 2在接種9 d后，崗梅枝干部出現(xiàn)深褐色病變，病變部位中間有白色羽狀物（圖1c），與原采回的標(biāo)本崗梅枝枯病在田間自然病害特征一樣，病斑有逐漸擴(kuò)大的趨勢(shì)，分離物Gangmei 1、Gangmei 3未引起崗梅產(chǎn)生病變。從接種后崗梅發(fā)病莖部的病健交界處組織上（圖1c）再次進(jìn)行病原菌的分離純化，此次分離的菌物在PDA平板上的菌落形態(tài)（圖2a～b）和分子特征（ITS）與原接種體一致。

2.2 崗梅枝枯病病原菌的形態(tài)學(xué)特征

Gangmei 2在PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后的菌落近圓形，邊緣規(guī)則，正面為白色絲絨狀，反面淡黃色，有輪紋，菌體由內(nèi)而外呈波浪形擴(kuò)張，整體蓬松，10 d后產(chǎn)孢（圖2a～b）;對(duì)病部進(jìn)行切片觀察到分生孢子盤埋生于寄主表皮下，黑色，單腔，分生孢子整齊地排列在分生孢子盤內(nèi)（圖2c）;光學(xué)顯微鏡下觀察到分生孢子大小為（19.8～29.5）μm×（52～9.9）μm（圖2d），呈紡錘形或長(zhǎng)梭形，直或微彎，具4個(gè)隔膜，5個(gè)細(xì)胞，分隔處稍有縊縮，基部和頂部細(xì)胞無色，中間3個(gè)細(xì)胞均為淡橄欖色，其中上部?jī)蓚€(gè)細(xì)胞顏色較下部細(xì)胞顏色深;成熟孢子頂端有2～4根無色透明附屬絲，分支或不分支，長(zhǎng)為24.5～36 μm，基部細(xì)胞平截，具一內(nèi)生附屬絲，長(zhǎng)為9.05～12.96 μm，不分支。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，此病原菌屬于擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌。

2.3 崗梅枝枯病病原菌的分子鑒定

利用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4對(duì)病原菌Gangmei 2的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段大小約為524 bp的產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物序列（MG820124）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，用MEGA 7.0按照NJ（neighborjoining）法構(gòu)建Gangmei 2及相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，病原菌株Gangmei 2與Pestalotiopsis microspora strain CGJ4（KT459350.1）、P.microspora strain Pm1（MH094237.1）、P.microspora strain DPX32（KY849799.1）和P.microspora strain LK11（DQ001009.1）在同一分支上。

3 討論

本研究對(duì)采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣的崗梅枝枯病樣品進(jìn)行組織分離純化，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證獲得崗梅枝枯病病原菌株，觀察病原菌株形態(tài)學(xué)特征并對(duì)病原菌株的ITS序列進(jìn)行分析后，初步將崗梅枝枯病的病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢P.microspora。

本研究結(jié)果與袁勤峰等[3]報(bào)道的崗梅枝枯病病原為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides complex，何凌冰等[4]報(bào)道的崗梅枝枯病病原為葡萄座腔菌B.dothidea不同，其原因可能是采樣的地點(diǎn)、季節(jié)、崗梅植株的生長(zhǎng)環(huán)境不同，也可能是崗梅枝枯病可由多種病原菌引起或存在多種病原菌復(fù)合侵染的情況。

韋繼光[8]的研究表明，擬盤多毛孢屬分類的首要特征是分生孢子有色胞的顏色類型，其次是頂端附屬絲（頂端附屬絲末端是否膨大、是否呈單根后分支、附屬絲著生位置以及根數(shù)）及基部附屬絲的有無、是否分叉。宋利沙[9]的研究表明，基部附屬絲的有無及是否分叉與頂端附屬絲是否呈單根后分支以及著生的位置，不是很重要的分類特征。

本研究使用了ITS序列對(duì)崗梅枝枯病病原菌進(jìn)行分子鑒定。宋利沙[9]的研究表明，該序列能區(qū)分?jǐn)M盤多毛孢屬中包括P.microspora在內(nèi)的6個(gè)物種，建議把ITS作為擬盤多毛孢屬的主要條形碼，βtub作為擬盤多毛孢屬的輔助條形碼，對(duì)于個(gè)別比較難以鑒別的種類，可采取ITS+βtub+EF1α序列組合建立分子系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)擬盤多毛孢屬物種進(jìn)行識(shí)別。本研究利用ITS序列構(gòu)建病原菌株及相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹能很好地將P.microspora與其他菌株區(qū)分開。

傳統(tǒng)的擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis分類多數(shù)以Guba[10]的檢索表為依據(jù)，但該檢索表存在形態(tài)特征重疊嚴(yán)重，種間區(qū)別不夠明確等不足之處[11]。擬盤多毛孢屬真菌在培養(yǎng)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)同種菌株在不同培養(yǎng)基上的分生孢子長(zhǎng)度、頂端附屬絲長(zhǎng)度、基部附屬絲長(zhǎng)度等形態(tài)指標(biāo)有明顯差別的現(xiàn)象[12]，不同的研究者對(duì)同一個(gè)種的描述也有差別。在擬盤多毛孢屬真菌的分類和鑒定中，應(yīng)統(tǒng)一培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件從而對(duì)擬盤多毛孢屬真菌進(jìn)行形態(tài)特征的比較并結(jié)合形態(tài)特征和分子特征進(jìn)行正確鑒定。迄今為止，國內(nèi)外未見有小孢擬盤多毛孢P.microspora引起崗梅枝枯病的報(bào)道，該發(fā)現(xiàn)為崗梅枝枯病的防治提供了一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）