宋曉宇 劉勇 陳建斌

摘要 番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus（TSWV）是嚴(yán)重危害世界經(jīng)濟(jì)作物的一種病毒，寄主范圍廣泛。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒能侵染我國大蒜Allium sativum L.。利用摩擦接種法將TSWV接種到健康大蒜上，結(jié)果顯示：接種14 d后大蒜新生葉片出現(xiàn)褪綠和白色斑點(diǎn)癥狀。ELISA檢測顯示大蒜葉片汁液與TSWV的單克隆抗體產(chǎn)生血清學(xué)反應(yīng)，采用TSWV N基因的引物對(duì)大蒜葉片總RNA進(jìn)行RTPCR，結(jié)果擴(kuò)增出約800 bp的條帶，在NCBI上BLAST顯示與TSWV YN5576的同源性最高，為98.52%。這些數(shù)據(jù)表明番茄斑萎病毒系統(tǒng)侵染我國大蒜。

關(guān)鍵詞 番茄斑萎病毒; 大蒜; 鑒定; RTPCR

中圖分類號(hào)： S 436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018266

Abstract Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV） causes severe damages to economic crops worldwide， and it can infect a wide range of plant hosts. To determine whether TSWV infect Chinese garlic， the extracts of Nicotiana benthamiana leaves that were infected with TSWV were rubinoculated to garlic plants. Garlic plants showed chlorotic and white spot symptoms on new leaves at 14 d post inoculation. Then the garlic leaves were detected by ELISA and RTPCR.Positive results were obtained in the DotELISA of the garlic leaf extracts with monoclonal antibody of TSWV. Furthermore， the target fragments of 800 bp were obtained from all infected garlic leaves by RTPCR using the specific primers for N gene of TSWV. The sequence of the RTPCR products from infected garlic leave was analyzed at NCBI， and the results showed that it shared 98.52% of nucleic acids with TSWV YN5576 isolate. Therefore， our results showed that Chinese garlic could be infected by TSWV.

Key words Tomato spotted wilt tospovirus; garlic; identification; RTPCR

番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt tospovirus （TSWV）屬于番茄斑萎病毒科Tospoviridae， 番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus，是世界上最具經(jīng)濟(jì)危害性的十種病毒之一[1]。TSWV病毒粒子為直徑80～100 nm的球形[2]，基因組由3個(gè)單鏈RNA組成，根據(jù)分子量的大小從大到小分別為 L RNA（8.9 kb）、 M RNA（4.8 kb）和 S RNA（2.9 kb）[34]。TSWV可以感染84個(gè)科1 090種植物，其中包括辣椒、番茄、茄子等農(nóng)作物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[5]。感染TSWV的植物癥狀包括：葉片葉面皺縮、出現(xiàn)圓環(huán)狀斑點(diǎn)，嚴(yán)重者葉片壞死脫落;根部和莖稈壞死;植株矮小等[6]。TSWV通過薊馬傳播，主要通過西花薊馬Frankliniella occidentalis以持續(xù)循環(huán)增殖的方式傳播。薊馬在1齡若蟲時(shí)期獲毒，成蟲時(shí)期傳毒[2]。

大蒜Allium sativum L.屬于百合科Liliaceae蔥屬Allium。我國是世界上最大的大蒜生產(chǎn)國和出口國，現(xiàn)在大蒜主要分布在山東、河南、云南、四川、江蘇等省。已報(bào)道的侵染大蒜的病毒主要屬于3個(gè)病毒屬，分別是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus、香石竹潛隱病毒屬Carlavirus和青蔥X病毒屬Allexivirus，且多為復(fù)合侵染，國外已有報(bào)道表明TSWV能夠侵染大蒜[7]，但能否侵染中國大蒜尚未有報(bào)道。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒能侵染中國大蒜。為了確定TSWV確實(shí)能感染中國大蒜，我們通過汁液摩擦接種的方式對(duì)大蒜進(jìn)行接種，觀察其癥狀，進(jìn)而通過免疫學(xué)、分子生物學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大蒜：播種在溫室中，溫度控制在27℃±1℃、相對(duì)濕度75%±5%、光照周期 L∥D=16 h∥8 h，不噴灑農(nóng)藥且保持無病蟲害狀態(tài)。待植株10 cm高（約兩周）時(shí)供試。

1.2 汁液摩擦接種

采用人工汁液摩擦接種的方法接種番茄斑萎病毒（TSWV）：選取發(fā)病明顯的本氏煙植株，取頂部發(fā)病葉片約1 g，加入10 mL接種緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 7.0），研磨充分，在大蒜葉片頂端撒上金剛砂粉末（約500目），用棉簽蘸取配好的接種液順著葉脈伸展方向輕輕摩擦葉片，過約10 min用清水將摩擦過的葉片清洗干凈，共接種10株大蒜，以摩擦接種緩沖液作為對(duì)照。過2～3周觀察發(fā)病狀況。

1.3 TSWV的ELISA檢測

選取發(fā)病明顯的4株大蒜，從頂部新葉葉片取0.1 g組織，加入PBS緩沖液500 μL，旋渦振蕩40 s，4℃下8 000 g離心3 min，取上清液。采用上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司TSWV ELISA Kit進(jìn)行檢測。對(duì)照設(shè)置：取感染TSWV的本氏煙葉片作為陽性對(duì)照，接種緩沖液的健康大蒜為陰性對(duì)照。

1.4 TSWV的分子生物學(xué)鑒定

選取發(fā)病明顯的4株大蒜，從頂部新葉葉片取01 g組織，采用TRIzol法提取總RNA。取5 μL RNA作為模板，采用諾唯贊生物技術(shù)公司兩步法RTPCR/qPCR試劑盒合成cDNA。體系20 μL： RNAasefree ddH2O 2 μL，RNA模板5 μL，Random hexamers 1 μL，2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL。反應(yīng)程序：50℃ 45 min;85℃ 2 min。

以擴(kuò)增TSWV N基因的特異引物TSWVNF2037：5′CTGCTTTYAAGCAAGTTCTGC3′與TSWVNR2825：5′ATCATCATGTCTAAGGTTAAGCTC3′對(duì)TSWV的核衣殼蛋白N基因進(jìn)行擴(kuò)增[8]。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL，5×SF Buffer 10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各2 μL，Phanta SuperFidelity DNA Polymerase 1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min;95℃變性10 s，50℃退火30 s;72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)凝膠成像儀的結(jié)果，用OMEGA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送生工生物工程有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種TSWV后癥狀觀察

2.2 TSWV的ELISA檢測

如表1所示，經(jīng)空白對(duì)照調(diào)零后，陽性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照孔平均值≤0.10;說明試驗(yàn)有效。大蒜樣品滿足OD值高于臨界值（CUT OFF）（臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15）和I/H值>2.5，表明檢測的4株大蒜的葉片均呈現(xiàn)陽性。以上數(shù)據(jù)說明該樣品可能被TSWV侵染。

2.3 TSWV的RTPCR檢測

采用TSWV N基因的特異性引物對(duì)4株ELISA呈現(xiàn)陽性的大蒜葉片進(jìn)行RTPCR，產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，顯示接種TSWV的大蒜葉片擴(kuò)增出大約800 bp的條帶，而接種緩沖液的對(duì)照大蒜沒有擴(kuò)增出條帶。

3 討論

我國的大蒜產(chǎn)量在全世界居于首位[9]，大蒜也是我國創(chuàng)匯最多的蔬菜產(chǎn)品[10]。病毒病是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的重要因素，目前尚未有根治病毒病的有效方法，主要還是以預(yù)防為主。大蒜主要采取無性繁殖的生殖方式，更容易造成病毒的積累和繼代傳播，對(duì)病毒的抗性逐步降低，最終造成蒜種的嚴(yán)重退化[11]，進(jìn)而影響大蒜的產(chǎn)量與質(zhì)量。病毒病現(xiàn)已成為影響我國大蒜生產(chǎn)的重要因素。因此確定侵染大蒜的病毒種類對(duì)大蒜病毒病的防治和提高大蒜產(chǎn)量尤為重要。

TSWV主要通過西花薊馬傳播，TSWV的擴(kuò)散與西花薊馬的分布密切相關(guān)[12]。我國大部分地區(qū)都適宜西花薊馬生存[13]，我國自2013年首次在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)西花薊馬后[14]，山東、吉林、湖南、貴州等地接連報(bào)道發(fā)現(xiàn)西花薊馬[1518]。1986年在我國南方的花生上首次發(fā)現(xiàn)了TSWV[19]。隨著西花薊馬在我國迅速傳播，TSWV也隨著薊馬的傳播而迅速擴(kuò)張至全國，同時(shí)TSWV對(duì)我國農(nóng)作物危害的面積和程度也在增加。到目前為止，TSWV在四川、廣東、北京、山東[2023]等地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，這與大蒜的主產(chǎn)區(qū)高度重合。TSWV寄主十分廣泛，包括辣椒、番茄、花生、馬鈴薯等農(nóng)作物。由于我國的地形與氣候特點(diǎn)，我國蔬菜生產(chǎn)主要集中在華北地區(qū)、長江中下游地區(qū)、四川盆地、華南地區(qū)，因此大蒜主產(chǎn)區(qū)往往也廣泛種植有TSWV的寄主農(nóng)作物，極易造成TSWV的跨物種傳播。西花薊馬又是為害大蒜的主要害蟲，我們檢測到TSWV可以感染中國大蒜，因此存在TSWV在自然條件下通過薊馬跨物種感染中國大蒜的可能。我們的結(jié)論可為大蒜病毒病的監(jiān)測和防治提供參考。

參考文獻(xiàn)

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[4] DE HAAN P， KORMELINK R， DE OLIVEIRA RESENDE R， et al. Tomato spotted wilt virus L RNA encodes a putative RNA polymerase [J].Journal of General Virology，1991，72（9）：22072216.