潘鵬亮 張方梅 尹健

Key words Histia rhodope; numerical taxonomy; feature extraction; veinjunction; sex identification

重陽木斑蛾Histia rhodope Cramer，又名重陽木帆錦斑蛾[1]、重陽木錦斑蛾[2]，屬于鱗翅目Lepidoptera斑蛾科Zygaenidae昆蟲，其寄主植物除重陽木Bischofia trifoliata Hook外，還包括板栗Castanea mollissima Blume[3]。據(jù)《中國農(nóng)業(yè)昆蟲》和《中國蛾類圖鑒（Ⅰ）》描述，該害蟲雄蛾翅展47～54 mm，雌蛾61～64 mm[45]。1983年戴鳳鳳報(bào)道江西德興縣大茅山地區(qū)重陽木斑蛾雌雄成蟲翅展分別為50～60 mm和44～50 mm[6]。另據(jù)報(bào)道，在福州該蟲的體長、翅展和翅長在雌雄間無明顯差異[7]。通過文獻(xiàn)比較，我們發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)或不同年份關(guān)于重陽木斑蛾雌雄成蟲翅展或翅長的描述不盡相同，雌雄個(gè)體間在翅形和翅長等方面有無差異存在一定爭議。

圖像處理與分析技術(shù)的發(fā)展為此類問題的解決提供了強(qiáng)有力的工具。利用相關(guān)技術(shù)，國內(nèi)外有許多關(guān)于不同種類昆蟲翅形結(jié)構(gòu)差異等方面的報(bào)道。比如，在膜翅目Hymenoptera昆蟲中，Weeks等在20世紀(jì)末報(bào)道了5種姬蜂科Ichneumonidae昆蟲的翅形態(tài)差異，并實(shí)現(xiàn)了此類昆蟲的種類鑒定[89]，出現(xiàn)了用于此類昆蟲形態(tài)特征提取與鑒定的軟件ABIS[10]和DrawWing[11]。在鱗翅目Lepidoptera昆蟲鑒定中，Watson等利用DAISY（digital automated identification system）系統(tǒng)對(duì)237種（每種20個(gè)進(jìn)行訓(xùn)練）活體標(biāo)本圖像進(jìn)行了分析，平均正確率83%，而無法對(duì)鱗片缺失或光照不均勻圖片進(jìn)行正確的歸類[12]，后續(xù)通過對(duì)35種鱗翅目昆蟲774個(gè)活體標(biāo)本的處理，并通過數(shù)據(jù)挖掘分析，成功率略有上升，達(dá)到85%[13]。而Zhu 等使用翅圖的顏色特征，如顏色直方圖和灰度共生矩陣等特征，對(duì)100種鱗翅目昆蟲的正確識(shí)別率為71.1%[14]。除了利用與上述顏色或光照影響相關(guān)的特征外，利用翅輪廓特征對(duì)昆蟲進(jìn)行分類鑒定效果要好一些，如Yang等利用翅輪廓特征對(duì)120張7種蝶角蛉Ascalaphidae圖片進(jìn)行分析，準(zhǔn)確率為90%～98%，而再添加復(fù)眼特征后，準(zhǔn)確率會(huì)上升到99%[15]。這說明，依托昆蟲數(shù)字化技術(shù)的數(shù)值分類效果與特征選擇有很大關(guān)系，同時(shí)也與昆蟲種類有密切關(guān)系。根據(jù)上述研究結(jié)果，可以初步認(rèn)為翅形等特征是昆蟲數(shù)值分類鑒定中的重要參數(shù)來源。

為了明確重陽木斑蛾成蟲不同性別之間在翅形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異，本研究擬利用圖像處理與分析技術(shù)，對(duì)信陽地區(qū)發(fā)生的重陽木斑蛾進(jìn)行形態(tài)測量學(xué)研究。研究結(jié)果不但可以為鱗翅目昆蟲數(shù)值分類提供理論依據(jù)，為此類昆蟲種類的遠(yuǎn)程鑒定篩選有效的參數(shù)，也為此類昆蟲成蟲的雌雄鑒定提供技術(shù)保障，為解決蝶類等雌雄難辨昆蟲的性別鑒定提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本處理

本試驗(yàn)中的重陽木斑蛾成蟲（圖1）采集時(shí)間為2017年8月20日，采集地點(diǎn)為河南省信陽市信陽農(nóng)林學(xué)院校內(nèi)，采集之前未使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，可以排除使用殺蟲劑對(duì)成蟲翅形態(tài)特征的影響。從整理后的標(biāo)本可以看出雌雄間除個(gè)體大小有差異外，腹部黑斑的大小以及黑斑間距在雌雄個(gè)體間有明顯不同，但從生態(tài)照片上很難進(jìn)行區(qū)分（圖1）。

雌雄成蟲各50頭進(jìn)行乙酸乙酯熏蒸處理，剪取前后翅并使用化學(xué)去鱗方法[16]，去除翅表鱗片，制作成翅脈標(biāo)本。最終選擇翅面無折疊、無破損的完整翅脈標(biāo)本雌雄各19頭進(jìn)行圖像獲取和特征提取，共得到雌雄左前翅圖片各19張，雌蟲右前翅圖片16張，雄蟲右前翅圖片13張。而由于后翅柔軟、易破損，只得到雌蟲左后翅圖1張、右后翅圖6張，雄蟲右后翅圖3張，這部分?jǐn)?shù)據(jù)過少，未做分析。

1.2 圖像獲取

本研究使用愛普生平板式掃描儀（Epson Perfection V370 Photo）作為翅圖像獲取的主要工具。通過比較幾種掃描模式（膠片、反射稿、反射稿+平面光源）的圖像效果，最終選擇使用膠片模式進(jìn)行掃描，分辨率設(shè)定為2 400 dpi。每個(gè)翅作為獨(dú)立文件保存為.bmp格式，以便后期各軟件的特征提取。

1.3 特征提取

本研究首先使用了由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)IPMist實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的BugShape v1.0軟件[17]，對(duì)翅的外部形態(tài)特征進(jìn)行了自動(dòng)獲取，為保證提取的參數(shù)能準(zhǔn)確代表翅的輪廓特征，每張翅圖提取兩次，一次為所有參數(shù)由軟件自動(dòng)調(diào)節(jié)，另一次為手動(dòng)調(diào)節(jié)，最終得到翅的面積、周長、長軸長度、短軸長度、等效圓半徑、偏心率、緊湊度、葉狀性和圓形度10個(gè)參數(shù)[18]。此外，利用美國F. James Rohlf開發(fā)的一系列tps軟件（http：∥129.49.19.42/ee/rohlf/software.html）進(jìn)行了翅脈交叉點(diǎn)數(shù)據(jù)提取與分析，如利用tpsDig2[19]獲取重陽木斑蛾前翅內(nèi)部13個(gè)翅脈交叉點(diǎn)數(shù)據(jù)等。

1.4 分析方法

同一性別重陽木斑蛾左右前翅看作兩個(gè)處理，不同性別前翅作為兩個(gè)處理，利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)檢測由BugShape v1.0軟件得到的10個(gè)參數(shù)在不同處理中的差異性。在進(jìn)行典型判別分析（canonical discriminat analysis）時(shí)，把兩個(gè)性別和左右兩側(cè)的翅分別看作不同的處理，即4個(gè)處理（雌性左翅、雌性右翅、雄性左翅和雄性右翅），通過獲得的參數(shù)建立Fisher判別函數(shù)，并對(duì)各樣本進(jìn)行分組判別，上述分析在SPSS 22.0中進(jìn)行。而利用tpsDig2獲取的翅脈交點(diǎn)坐標(biāo)，使用其專用的軟件tpsSuper進(jìn)行普氏疊加分析，疊加分析后再利用tpsRelw進(jìn)行相對(duì)扭曲分析[19]，以分析重陽木斑蛾翅內(nèi)部翅脈交叉點(diǎn)在空間分布上的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 成蟲左右前翅形態(tài)學(xué)參數(shù)在同一性別中的差異

雌蟲數(shù)據(jù)通過Levene變異數(shù)相等測試，各參數(shù)的顯著性P值在0.123～0.945之間，說明雌蟲左前翅和右前翅數(shù)據(jù)集整齊度好。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（n=19，16）結(jié)果表明，各參數(shù)的顯著性P值范圍為0.289～0.878，差異均不顯著。同樣，在雄蟲左右前翅相關(guān)參數(shù)的檢驗(yàn)中，Levence變異數(shù)檢測中各參數(shù)的顯著性P值范圍為0.339～0.968。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯著性P值范圍為0.268～0.991，各參數(shù)間差異也不顯著（圖2）。

2.2 雌雄成蟲左前翅在形態(tài)學(xué)參數(shù)上的差異

大多數(shù)情況下，進(jìn)行鱗翅目昆蟲種類的鑒定，利用翅面特征只使用一側(cè)的翅表斑紋等。本文首先分析了雌雄成蟲左前翅形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，Levene變異數(shù)相等測試表明各參數(shù)顯著性P值范圍為0.228～0.927，處理內(nèi)各樣本間差異很小。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明，左前翅面積（t=5.787，df=36，P<0.001）、短軸長度（t=8.977，df=36，P<0.001）、等效圓半徑（t=5.733，df=36，P<0.001）、偏心率（t=-7.966，df=36，P<0.001）、球狀性（t=5.420，df=36，P<0.001）和圓形度（t=6.843，df=36，P<0.001）在不同性別間差異達(dá)到極顯著水平，周長（t=2.641，df=36，P=0.012）和長軸長度（t=2.357，df=36，P<0.024）差異達(dá)到顯著水平，而緊湊度（t=1.335，df=36，P=0.190）和葉狀性（t=-0.664，df=36，P=0.511）在兩個(gè)性別間差異不顯著（圖3）。

2.3 雌雄成蟲雙側(cè)前翅形態(tài)學(xué)參數(shù)的差異

雖然同一性別成蟲左右前翅的形態(tài)特征在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，可以簡單地推斷出左右翅基本對(duì)稱，但可以看出左右翅并不是完全對(duì)稱的，當(dāng)左右翅混合使用時(shí)，這種微小差異是否會(huì)影響性別的最終判定需要做進(jìn)一步的證明。因此，本文把每一性別左右翅數(shù)據(jù)重新組合成一個(gè)新的數(shù)據(jù)集，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，Levene變異數(shù)據(jù)相等測試顯著性P值范圍為0.076～0.788。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明，雌雄兩性間翅面積（t=8.437，df=65，P<0.001）、周長（t=4.478，df=65，P<0.001）、長軸長度（t=4.385，df=65，P<0.001）、短軸長度（t=11.642，df=65，P<0.001）、等效圓半徑（t=8.513，df=65，P<0.001）、偏心率（t=-10.090，df=65，P<0.001）、球狀性（t=7.907，df=65，P<0.001）和圓形度（t=8.194，df=65，P<0.001）之間的差異均達(dá)到極顯著水平，而緊湊度（t=1.938，df=65，P=0.057）和葉狀性（t=-0.506，df=65，P=0.614）差異不顯著（圖4）。

2.4 雌雄判別結(jié)果

利用典型判別分析（canonical discriminant analysis）建立4個(gè)Fisher判別函數(shù)，在判別分析中用到3個(gè)。其中第1個(gè)函數(shù)的貢獻(xiàn)率為93.6%，第2個(gè)函數(shù)的貢獻(xiàn)率為4.7%。從最終的分類結(jié)果來看，會(huì)出現(xiàn)左右翅相互誤判現(xiàn)象。其中，左前翅的分組正確率（86.85%）明顯高于右前翅（67.55%）。但雌雄兩性間無誤判現(xiàn)象（100.00%），其分組散布圖如下（圖5）。

2.5 翅脈交叉點(diǎn)空間位置變化

通過普氏疊加和相對(duì)扭曲分析發(fā)現(xiàn)，所研究的樣本無論是雌性或是雄性，翅脈交叉點(diǎn)在翅膀橫向上的變化較大，且外圍兩個(gè)翅脈交叉點(diǎn)變異最大。通過相對(duì)扭曲分析，絕大部分樣本翅脈內(nèi)部交叉點(diǎn)的變異不大，有部分樣本（雌性5個(gè)，雄性4個(gè)）存在較大變異。雌雄作為兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析時(shí)，差異變化最大的翅脈交叉點(diǎn)為標(biāo)號(hào)5和6兩個(gè)點(diǎn)（圖6）。

3 結(jié)論與討論

通過上述分析，本研究認(rèn)為重陽木斑蛾成蟲左右前翅在輪廓特征上無顯著差異，雌雄間存在顯著差異。其中，僅利用左前翅的10個(gè)輪廓特征參數(shù)進(jìn)行比較時(shí)，翅面積、短軸長度、等效圓半徑、偏心率、球狀性和圓形度在兩個(gè)性別間的差異達(dá)到極顯著水平，周長和長軸長度的差異達(dá)到顯著水平，而緊湊度和葉狀性的差異不顯著。利用兩側(cè)前翅的數(shù)據(jù)集時(shí)，除緊湊度和葉狀性的差異不顯著外，其余參數(shù)均達(dá)到極顯著水平。雖然利用左前翅的數(shù)據(jù)集在進(jìn)行判別分析時(shí)分組正確率達(dá)到86.85%，且顯著高于右前翅的正確率（67.55%），存在左右翅誤判的情況，但整體數(shù)據(jù)集對(duì)雌雄無誤判現(xiàn)象。雌性或雄性個(gè)體間在翅脈交叉點(diǎn)空間位置上的變化多發(fā)生在相對(duì)于翅的橫向方向，且外緣附近的變異更大。

在研究過程當(dāng)中，最初使用未去除鱗片的翅，但在圖像獲取時(shí)鱗片容易脫落，污染背景，且無法準(zhǔn)確獲取翅脈交叉點(diǎn)位置，利用化學(xué)方法去除鱗片[20]是獲取鱗翅目昆蟲翅脈的關(guān)鍵一步。但這種方法的缺點(diǎn)是只適用于普通昆蟲標(biāo)本，而對(duì)于珍稀標(biāo)本，建議使用其他非破壞性操作方法，如微型計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)（microcomputed tomography）[21]等。

本研究結(jié)果認(rèn)為從前翅的輪廓特征來看，同一性別個(gè)體間無顯著差異，僅利用這些特征可以對(duì)重陽木斑蛾成蟲進(jìn)行雌雄區(qū)別，并且可以左右翅相互替換。從實(shí)際的測量值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）來看，雌雄間雙側(cè)前翅的面積[♀：（227.92±4.085）mm2;♂：（185.23±2.84）mm2]、周長[♀：（84.26±1.24）mm;♂：（77.41±0.85）mm]、長軸長度[♀：（27.19±0.28）mm;♂：（25.56±0.24）mm]、短軸長度[♀：（11.35±0.11）mm;♂：（9.77±0.08）mm]、等效圓半徑[♀：（8.51±0.08）mm;♂：（7.67±0.06）mm]存在顯著差異，在這些指標(biāo)上雌性大于雄性，這支持了參考文獻(xiàn)[46]中的描述。

而從翅脈交叉點(diǎn)的空間分布來看，不但雌雄間存在較大差異，同一性別不同個(gè)體間也存在顯著差異，主要表現(xiàn)在相對(duì)于翅的橫向方向的變化，并且靠近外緣的翅脈交叉點(diǎn)位置變化大。許多標(biāo)本中會(huì)出現(xiàn)翅脈交叉點(diǎn)位置缺失或多出，因此所選翅脈交叉點(diǎn)相對(duì)位置有很大變化。據(jù)報(bào)道，在一些膜翅目和雙翅目昆蟲中，翅脈交叉點(diǎn)位置的相對(duì)變化是評(píng)價(jià)其不同亞種或近似種的重要依據(jù)[11， 2223]。而在一些水生昆蟲中，不良的環(huán)境條件和殺蟲劑很可能影響到昆蟲左右對(duì)稱性[24]。本研究采集標(biāo)本之前，采集地從未使用殺蟲劑進(jìn)行防治，基本可以排除殺蟲劑對(duì)重陽木斑蛾成蟲翅形的影響。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，鱗翅目昆蟲翅脈交叉點(diǎn)的空間變異，可以用于區(qū)別不同夜蛾科昆蟲[19]，但是否適用于所有鱗翅目或其他種類的昆蟲，能否形成適合絕大多數(shù)昆蟲的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫，這些還需要做進(jìn)一步的研究。

在鱗翅目昆蟲的飼養(yǎng)和應(yīng)用當(dāng)中，尤其是對(duì)蝴蝶雌雄的判別方面，除了專業(yè)的分類人員可以通過生殖器結(jié)構(gòu)、體和翅正反面彩色鱗片和鱗毛的差異等特征進(jìn)行鑒別外，大部分工作人員很難準(zhǔn)確判斷。對(duì)于研究中的重陽木斑蛾成蟲來說，雌雄間除了翅的形態(tài)特征可用于數(shù)字化鑒定外，通過腹末生殖節(jié)形態(tài)也可以做出較準(zhǔn)確的判斷。一般情況下雌性產(chǎn)卵器為管狀外伸，而雄性腹部末端較平截（圖1）。另外，雌蟲腹部成對(duì)的黑斑多相連，而雄性腹部成對(duì)的黑斑多分離。但對(duì)于其他鱗翅目昆蟲來說，這些并不是穩(wěn)定的鑒定特征。如果能夠通過翅的形態(tài)特征區(qū)別此類昆蟲的種類和雌雄，將有利于此類昆蟲的數(shù)字化鑒定，形成標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)庫，推動(dòng)鱗翅目或其他昆蟲種類的遠(yuǎn)程鑒定功能。

參考文獻(xiàn)

[1] 李世廣，林華峰，李利華，等.重陽木帆錦斑蛾的生物學(xué)特性及防治[J].昆蟲知識(shí)，2006，43（6）：777780.

[2] 周英.一種分辨重陽木錦斑蛾雌雄蛹的簡易方法[J].中國森林病蟲，2012，31（6）：4041.

[3] 申效誠.河南昆蟲名錄[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1993.

[4] 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所.中國農(nóng)業(yè)昆蟲（下冊(cè)）[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1987.

[5] 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所.中國蛾類圖鑒I[M].北京：科學(xué)出版社，1981.

[6] 戴鳳鳳.重陽木斑蛾的初步觀察[J].江西林業(yè)科技，1983（4）：2122.

[7] 黃邦侃.重陽木斑蛾的生物學(xué)及防治研究[J].福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1980（1）：6179.

[8] WEEKS P， GAULD I， GASTON K， et al. Automating the identification of insects： A new solution to an old problem [J]. Bulletin of Entomological Research， 1997， 87 （2）： 203211.

[9] WEEKS P J D， ONEILL M A， GASTON K J， et al. Speciesidentification of wasps using principal component associative memories [J]. Image and Vision Computing，1999，17（12）：861866.

[10]SCHRDER S， DRESCHER W， STEINHAGE V， et al. An automated method for the identification of bee species （Hymenoptera： Apoidea）[C]∥Proceedings of the International Symposium on Conserving Europes Bees， Londres， Reino Unido. 1995： 67.

[11]TOFILSKI A. DrawWing， a program for numerical description of insect wings [J].Journal of Insect Science，2004，17（4）：15.

[12]WATSON A T， ONEILL M A， KITCHING I J. Automated identification of live moths （Macrolepidoptera） using digital automated identification system （DAISY）[J]. Systematics and Biodiversity，2004，1（3）：287300.

[13]MAYO M， WATSON A T. Automatic species identification of live moths [J]. KnowledgeBased Systems，2007，20（2）：195202.

[14]ZHU Leqing， ZHANG Zhe. Autoclassification of insect images based on color histogram and GLCM.2010 [C]∥Yantai： International Conference on Fuzzy System & Knowl， 2010： 25892593.

[15]YANG Heping， MA Chunsen， WEN Hui， et al. A tool for developing an automatic insect identification system based on wing outlines [J]. Scientific Reports，2015（5）：12786.

[16]潘鵬亮，沈佐銳，楊紅珍，等.三種絹蝶翅脈數(shù)字化特征的提取及初步分析[J].動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，2008，33（3）：566571.

[17]潘鵬亮，劉紅敏，張方梅，等.四種網(wǎng)蝽科昆蟲外部形態(tài)特征提取與分析[J].四川動(dòng)物，2017，36（5）：531539.

[18]于新文，沈佐銳，高靈旺，等.昆蟲圖像幾何形狀特征的提取技術(shù)研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，8（3）：4750.

[19]蔡小娜，黃大莊，沈佐銳，等.用于昆蟲分類鑒定的幾何形態(tài)計(jì)量學(xué)方法研究：相對(duì)扭曲分析[J].生物數(shù)學(xué)學(xué)報(bào)，2016（2）：254262.

[20]潘鵬亮，沈佐銳，高靈旺，等.昆蟲翅脈特征自動(dòng)獲取技術(shù)的初步研究[J].昆蟲分類學(xué)報(bào)，2008，30（1）：7280.

[21]POINAPEN D， KONOPKA J K， UMOH J U， et al. MicroCT imaging of live insects using carbon dioxide gasinduced hypoxia as anesthetic with minimal impact on certain subsequent life history traits [J]. BMC Zoology， 2017， 2 （9）： 13.

[22]FRANCOY T M， WITTMANN D， DRAUSCHKE M， et al. Identification of Africanized honey bees through wing morphometrics： Two fast and efficient procedures[J]. Apidologie，2008，39（5）：488494.

[23]GILCHRIST A S， CRISAFULLI D C A. Using variation in wing shape to distinguish between wild and massreared individuals of Queensland fruit fly， Bactrocera tryoni [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata，2006，119（2）：175178.

[24]CHANG Xiaoli， ZHAI Baoping， LIU Xiangdong， et al. Effects of temperature stress and pesticide exposure on fluctuating asymmetry and mortality of Copera annulata （Selys） （Odonata： Zygoptera） larvae [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2007，67（1）：120127.

（責(zé)任編輯：田 喆）