李立梅 毛 赫 左彤彤

摘要 黃瓜綠斑駁花葉病毒 Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）是葫蘆科作物的重要檢疫性病毒。本研究以田間自然感病的西瓜葉片為試材，采用RTPCR獲得該病毒（CGMMVLNYK）基因組全長(zhǎng)（登錄號(hào)MG745849），以pBluescript Ⅱ SK（）為載體，分別克隆其所編碼的4段基因，并采用人工接種驗(yàn)證它們的體外侵染活性。結(jié)果表明：該病毒與韓國(guó)分離物KW（登錄號(hào)AF417242）親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.8%，并成功克隆了CGMMVLNYK編碼的4段基因，分別記為RNA1～RNA4。經(jīng)人工接種，發(fā)現(xiàn)RNA1和RNA4能侵染葫蘆，表現(xiàn)明顯花葉癥狀，與該病毒接種葫蘆癥狀一致，且接種RNA1后的癥狀較RNA4明顯，4種RNA混合接種癥狀最為明顯，經(jīng)RTPCR檢測(cè)，發(fā)病植株可擴(kuò)增到與接種的RNA大小相等的片段。

關(guān)鍵詞 黃瓜綠斑駁花葉病毒; 基因組全長(zhǎng); 克隆

中圖分類(lèi)號(hào)： S 436.421

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018222

Abstract Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus of cucurbits. In this study， the complete nucleotide sequence of the virus （GenBank accession no. MG745849） was obtained by RTPCR in the naturally infected watermelon leaves. The four gene fragments encoded by the CGMMV were cloned into pBluescript Ⅱ SK（） containing T7 promoter， respectively， and the invasive activity in vitro was verified by artificial inoculation. The results showed that the CGMMV was most closely related to the KW （GenBank accession no. AF417242） isolated from Korea， with an identity of 99.8%. The 4 infectious gene fragments of the CGMMV were successfully constructed and the segments RNA1 and RNA4 could infect cucurbits and cause obvious systemic mosaic in leaves. Moreover， the symptoms caused by the segment RNA1 were more severe than those by RNA4 after artificial inoculation. The symptoms were most obvious when the four segments of RNA inoculated at the same time. The RNA fragment amplified in diseased plants was equal in length to the inoculated viral RNA by RTPCR.

Key words Cucumber green mottle mosaic virus; full length of genome; clone

黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）是葫蘆科作物的重要病毒，西瓜感染該病毒后植株生長(zhǎng)緩慢，果實(shí)內(nèi)部嚴(yán)重變色或腐爛，果肉纖維化、水漬狀，嚴(yán)重時(shí)喪失食用價(jià)值，俗稱(chēng)西瓜倒瓤病或血瓤病[1]。CGMMV給葫蘆科作物生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響，1998年在韓國(guó)大面積暴發(fā)，造成463 hm2絕收[2];2004年在巴基斯坦部分地區(qū)葫蘆科作物發(fā)病率達(dá)46.9%[3];2005年中國(guó)遼寧省蓋州市由于種子帶毒而導(dǎo)致西瓜大面積感染CGMMV，發(fā)生面積333 hm2，其中13 hm2絕收[4]，引起農(nóng)業(yè)部、質(zhì)檢總局等相關(guān)部門(mén)的高度重視。根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄（2014）》，遼寧、上海、江蘇、浙江、安徽、山東、湖北、湖南、廣東、廣西、海南等11個(gè)省市區(qū)74個(gè)縣市區(qū)均有CGMMV分布。迄今對(duì)于該病毒的致病機(jī)理研究多集中在生理生化水平，Adzhemyan等研究認(rèn)為黃瓜感染該病毒后可導(dǎo)致植株體內(nèi)可溶性糖和游離氨基酸含量的積累[5];Srivastava等研究表明該病毒可通過(guò)影響磷酸戊糖途徑，導(dǎo)致多酚氧化酶活性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)積累[6]。本研究首先測(cè)定了CGMMV國(guó)內(nèi)首發(fā)區(qū)的基因組全長(zhǎng)序列，然后依據(jù)全基因組序列分別克隆了該病毒編碼的4段基因，旨在找到可侵染寄主植物的基因，為今后該病科學(xué)有效的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試毒原及載體

自然感病的西瓜植株采自遼寧省營(yíng)口市，田間表現(xiàn)癥狀為葉片斑駁、花葉、葉脈綠帶狀、濃綠凹凸斑，經(jīng)RTPCR檢測(cè)，定名為CGMMVLNYK，采用汁液摩擦法繁殖保存在防蟲(chóng)溫室的葫蘆上;侵染性克隆載體為pBluescript Ⅱ SK（）載體。

1.1.2 試劑

TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen;LA Taq Polymerase、pMD18T simple vector、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、限制性?xún)?nèi)切酶Not Ⅰ和Xho Ⅰ、TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit （Code No.D6110A）、TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit （Code No. DR027A）、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase （Code No. DR010S）、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Code No. DV805A）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、TaKaRa in vitro Transcription T7 Kit （Code No. D6140）、TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6023）等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;Ribo m7G Cap Analog （Promega Code： P171B）購(gòu)自Promega生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

1.2 方法

1.2.1 RTPCR擴(kuò)增

參照Invitrogen公司的TRIzol法提取植物總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性后，以提取的植物總RNA為模板，使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit 合成cDNA，采用LA Taq Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段分別為1.1、2.4、2.5、0.7 kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒純化后克隆于pMD 18T載體，轉(zhuǎn)化 E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，以確定正確的堿基序列。

1.2.2 病毒的提純和電鏡觀察

病毒提純程序參考裘維蕃[8]的方法，病毒提純后采用負(fù)染法觀察，將銅網(wǎng)在樣品液滴上懸浮3～5 min，吸去多余的液體，再經(jīng)2%磷鎢酸（pH7.0）進(jìn)行負(fù)染色3～5 min，自然干燥后在透射電鏡下觀察藥劑處理不同時(shí)間下病毒粒子的形態(tài)。

1.2.3 基因克隆

依據(jù)所獲得的全基因組序列設(shè)計(jì)引物，以CGMMV營(yíng)口分離物的總RNA為模板，利用TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物使用TaKaRa 5′Full RACE Kit （D315）中的Random 9 mers;獲得cDNA后，采用巢氏PCR分別克隆CGMMV編碼的4個(gè)開(kāi)放閱讀框，第一步PCR使用TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，引物為ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/F1和ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/R1，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，引物為ORF1/ORF2/ORF3/ORF4/F2，ORF1/ORF2/ORF2/ORF4/R2，PCR產(chǎn)物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0切膠回收;回收產(chǎn)物引入酶切位點(diǎn)NotⅠ 和XhoⅠ，將所得的4個(gè)片段分別連入pBluescript Ⅱ SK（）載體，經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ酶切后，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0載體回收，使用TaKaRa DNA Ligation Kit中的連接酶，將回收后的目的片段與pBluescript Ⅱ SK/Not I/ Xho I，16℃，過(guò)夜連接;感受態(tài)細(xì)胞DH5α制備好后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，然后使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0提取質(zhì)粒，每個(gè)片段分別選擇兩個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，命名為ORF11、ORF12，ORF21、ORF22，ORF31、ORF32，ORF41、ORF42。先分別使用引物BcaBEST Primer M1320（TaKaRa Code No.D3881）和M13 Reverse （TaKaRa Code No.D3830）對(duì)所選質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，之后使用引物ORF1F528、ORF1R1614、ORF1F1447、ORF1F2022、ORF1F2588將ORF11、ORF12測(cè)通，使用引物CTD041F446對(duì)ORF21、ORF22測(cè)通。

1.2.4 體外轉(zhuǎn)錄

使用SacⅠ進(jìn)行單酶切，將目的質(zhì)粒線(xiàn)性化，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收酶切產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：SacⅠ酶切產(chǎn)物 3 μL，10×Transcription Buffer 2 μL，ATP Solution （50 mmol/L） 2 μL，UTP Solution （50 mmol/L） 2 μL，CTP Solution （50 mmol/L） 2 μL，GTP Solution （稀釋至10 mmol/L） 2 μL，Ribo m7G Cap Analog （40 mmol/L） 2 μL，RNase抑制劑（40 U/μL） 0.5 μL，T7 RNA聚合酶（50 U/μL） 2 μL，RNase Free dH2O定容至20 μL，上述體系中加入4 μL （即20U） DNaseⅠ，37℃反應(yīng)1 h，然后進(jìn)行純化（去除殘留的DNA），純化的操作流程為：加入30 μL 3 mol/L CH3COONa （pH5.2），加DEPC水至300 μL，混勻;加入300 μL PCI（苯酚、氯仿、異戊醇，比例為25∶24∶1），室溫靜置15 min，12 000 g，離心5 min;加入300 μL CI（氯仿，異戊醇，比例為24∶1），室溫靜置10 min，12 000 g，離心5 min，加入3 μL NA Carrier，混勻，加入300 μL異丙醇，冰浴10 min，12 000 g，離心5 min，加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇，洗滌，12 000 g，離心1 min，室溫干燥后溶于16.5 μL RNase Free dH2O中，分別標(biāo)記為RNA1、RNA2、RNA3、RNA4。

1.2.5 體外侵染

將獲得體外轉(zhuǎn)錄物RNA1、RNA2、RNA3、RNA4排列組合，進(jìn)行體外侵染，以期確定是哪段基因，或者哪幾段基因共同完成該病毒的侵染。接種方法：體外轉(zhuǎn)錄物與等體積的2×GKP pH9.2緩沖液（50 mmol/L 甘氨酸，30 mmol/L K2HPO4，1%膨潤(rùn)土，1%硅藻土）混合為接種液，取生長(zhǎng)良好，一葉一心的葫蘆Lagenaria siceraria（Molina） Standl（品種：‘不死鳥(niǎo)），將滅菌的石英砂均勻撒于待接種葉片上，每葉用10～20 μL接種液（內(nèi)含0.2 μg病毒），輕輕涂抹葉片，5 min后用無(wú)菌水沖洗。接種后的植株生長(zhǎng)于防蟲(chóng)的生長(zhǎng)箱中，溫度為25℃，保持12 h光照，觀察癥狀，于接種21 d后取樣，進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，以接種CGMMV為陽(yáng)性對(duì)照，以接種2×GKP pH9.2緩沖液為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMMV全基因序列的測(cè)定

2.1.1 RNA的提取與檢測(cè)

取采自遼寧省營(yíng)口蓋州地區(qū)的西瓜葉片樣品5份，提取總RNA，取1 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1：圖中所示3條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，所提的RNA完整性很好，沒(méi)有發(fā)生降解，可以用于下一步的試驗(yàn)。

2.1.2 RTPCR檢測(cè)及全基因組序列測(cè)定

以植物總RNA為模板，利用4 對(duì)引物通過(guò)RTPCR 擴(kuò)增得到4 條特異DNA片段，大小約為1.1、2.4、2.5和0.7 kb，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果相符，且擴(kuò)增得到4個(gè)特異片段相互重疊，覆蓋了CGMMV的完整基因組。產(chǎn)物克隆后經(jīng)藍(lán)白斑篩選，進(jìn)行雙向測(cè)序。經(jīng)比對(duì)，該分離物與韓國(guó)分離物（登錄號(hào)AF417242）親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.8%，與日本的SH株系、韓國(guó)的甜瓜分離物及印度Delhi地區(qū)的分離物的親緣關(guān)系亦較近，但與俄羅斯CGMMVMC及西班牙CGMMCSP分離物親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)，同源性?xún)H為90%。

2.2 CGMMVLNYK分段基因克隆

2.2.1 CGMMV的提取及病毒總RNA的提取

經(jīng)磷鎢酸負(fù)染色后在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病毒粒子直棒狀，長(zhǎng)約300 nm，寬約18 nm （圖2）。取病毒的RNA 1 μL，進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3，檢測(cè)結(jié)果表明，所提的RNA完整性很好，沒(méi)有發(fā)生降解，可用于下一步的克隆試驗(yàn)。

2.2.2 RTPCR擴(kuò)增結(jié)果

第一步RTPCR擴(kuò)增后，取5 μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4，將第一步PCR產(chǎn)物采用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5，分別得到了大小約為3.5、1.5、0.8、0.5 kb的片段，與預(yù)期的大小相符，純化后克隆，上述各PCR產(chǎn)物經(jīng)Not Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切后，切膠回收得到相應(yīng)大小的目的片段。

2.2.3 重組載體的構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增分別得到片段D1（3.5 kb）、D2（1.5 kb）、D3（0.8 kb）、D4（0.5 kb），與預(yù)期的大小相符，片段D1、D2、D3、D4 PCR產(chǎn)物回收酶切后分別連接至pBluescript Ⅱ SK （）載體，篩選出質(zhì)粒重組子，并測(cè)序以驗(yàn)證插入序列的正確性，使用DANMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，克隆得到的序列與原分離物一致，并未發(fā)現(xiàn)突變，可以用于下一步的體外轉(zhuǎn)錄。

2.3 體外轉(zhuǎn)錄

2.3.1 酶切產(chǎn)物回收

克隆得到的目的片段用SacⅠ酶切后，用電泳檢測(cè)確已切開(kāi)。分別命名為pCGMMV1、pCGMMV2、pCGMMV3、pCGMMV4（圖6a～d）。

2.3.2 體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳檢測(cè)

以線(xiàn)性化的pCGMMV為模板，采用加帽的方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，電泳發(fā)現(xiàn)，條帶不唯一，這其中有可能還存在線(xiàn)性化的模板，也有可能是RNA體外轉(zhuǎn)錄時(shí)出現(xiàn)了二級(jí)結(jié)構(gòu)，但均得到了目的大小的條帶，可以用于體外侵染。分別命名為RNA1、RNA2、RNA3、RNA4。（圖7a～d），同時(shí)使用Nanodrop超微量可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度檢測(cè)，濃度分別為1 105、1 380、1 320、1 190 ng/μL。

2.4 體外侵染

2.4.1 癥狀觀察

分別接種經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得的4種RNA及4種RNA的排列組合到葫蘆苗上，接種15 d后，發(fā)現(xiàn)接種RNA1、RNA4及含有RNA1、RNA4組合的葫蘆苗出現(xiàn)了不同程度的花葉癥狀，接種含有RNA1的處理比含有RNA4的癥狀明顯，其中含有4種RNA處理的癥狀最明顯，葉片出現(xiàn)壞死斑點(diǎn)（圖8a～i）。

2.4.2 RTPCR檢測(cè)

對(duì)所有接種植株取樣后進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，發(fā)病植株中可檢測(cè)到與RNA1和RNA4大小相等的片段，而未發(fā)病植株未擴(kuò)增到目的片段。

3 結(jié)論與討論

CGMMV是重要的種傳病毒，在我國(guó)多個(gè)葫蘆科作物種植區(qū)造成了不同程度的危害。遼寧省營(yíng)口市蓋州是我國(guó)CGMMV發(fā)生最早的地區(qū)，導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大。核苷酸序列提供了病毒之間親緣關(guān)系的重要信息。此前，國(guó)內(nèi)對(duì)CGMMV親緣關(guān)系的研究大多是基于其外殼蛋白的核酸序列，李紅霞等[9]報(bào)道的CGMMV的外殼蛋白序列分析顯示，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)、不同寄主的CGMMV分離物的外殼蛋白基因序列差異較小，同源率為97.5%～99.8%。本研究通過(guò)對(duì)遼寧省主要西瓜產(chǎn)區(qū)CGMMV西瓜分離物基因組的同源性分析顯示，遼寧省營(yíng)口市蓋州的CGMMV分離物與日本、韓國(guó)報(bào)道的CGMMV分離物親緣關(guān)系較近，尤其是韓國(guó)西瓜分離物，充分說(shuō)明遼寧省內(nèi)發(fā)生的CGMMV與日本、韓國(guó)等報(bào)道的CGMMV可能有共同的流行學(xué)意義上的侵染源，進(jìn)一步佐證了我國(guó)的CGMMV由日本、韓國(guó)引種傳入的推斷。

植物RNA病毒侵染性克隆由Ahlquist等[10]在雀麥花葉病毒Brome mosaic virus （BMV）首次報(bào)道，至今國(guó)外已有煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus （TMV）、馬鈴薯X病毒Potato virus X （PVX）、煙草脆裂病毒Tobacco rattle virus （TRV）等大量的植物病毒被成功地構(gòu)建了全長(zhǎng) cDNA侵染性克隆[1114]。RNA病毒的cDNA侵染性克隆技術(shù)的發(fā)展，使人們可以在DNA水平上開(kāi)展 RNA 病毒的分子生物學(xué)研究，將植物病毒侵染性克隆改造成病毒載體，可以用于外源基因在植物上的大量表達(dá)，為深入研究RNA病毒與寄主的相互作用機(jī)制提供了有效手段[15]。本研究以CGMMVLNYK為模板，分別將該病毒所編碼的4段基因克隆至pBluescript Ⅱ SK（）載體，并在體外完成轉(zhuǎn)錄，驗(yàn)證各段基因的侵染活性，通過(guò)體外侵染，自然條件下，通過(guò)傷口RNA2和RNA3不能成功侵染葫蘆，RNA1和RNA4可侵染葫蘆，發(fā)病癥狀和CGMMV自然條件下侵染葫蘆一致，從人工接種發(fā)病的葫蘆中檢測(cè)的基因序列和原病毒序列相似性為100%，符合柯赫氏法則 （Kochs Rule），而關(guān)于該病毒的報(bào)道，大部分報(bào)道猜想RNA1參與該病毒的復(fù)制，RNA4為該病毒的外殼蛋白。本研究成功獲得可體外侵染的RNA1和RNA4，初步證實(shí)這兩段基因直接導(dǎo)致寄主植物表現(xiàn)典型的花葉癥狀，但哪段基因與西瓜倒瓤直接相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：田 喆）