羅育發(fā) 吳凱 付丹

摘要 亞洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是蕓香科Rutaceae植物新梢期的重要害蟲，也是黃龍病Huanglongbing的主要傳播媒介，嚴(yán)重威脅江西柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文利用線粒體基因標(biāo)記，研究江西10個(gè)地點(diǎn)亞洲柑橘木虱的種群遺傳結(jié)構(gòu)和多態(tài)性。擴(kuò)增了2個(gè)線粒體COⅠ基因片段，長(zhǎng)度為1 431 bp。其中多態(tài)性位點(diǎn)2個(gè)（均為非同義突變，A/G轉(zhuǎn)換），單倍型3個(gè)（Hap1，Hap2和Hap3）。最常見的單倍型是Hap1（占總樣本數(shù)的91.7%），發(fā)生在所有采樣點(diǎn);其次為Hap3（6.3%），分布在大余和崇義;Hap2（2.0%）僅在興國(guó)出現(xiàn)。單一直線型的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模式、小而不顯著的HR（Harpendings raggedness）指數(shù)值，以及單峰型錯(cuò)配分布曲線均表明：江西地區(qū)的亞洲柑橘木虱是近期入侵并經(jīng)歷了快速的種群動(dòng)態(tài)擴(kuò)張。

關(guān)鍵詞 亞洲柑橘木虱; 柑橘黃龍病; 種群遺傳結(jié)構(gòu); COⅠ基因; 江西

中圖分類號(hào)： S 433.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018234

Abstract The Asian citrus psyllid Diaphorina citri Kuwayama （Hemiptera： Liviidae）， an important pest of the young developing leaves of Rutaceae， is the main vector of the bacterium that causes citrus greening disease （huanglongbing）. The population genetic structure and polymorphism of D.citri from 10 sites in Jiangxi were studied by using mitochondrial markers. Two fragments of mitochondrial COⅠ sequences were amplified with a total length of 1 431 bp. We found 2 polymorphic sites （nonsynonymous， A/G transition） and 3 haplotypes （Hap1，Hap2 and Hap3）. Among these， the most common haplotype was Hap1 （91.7% of the total） occurring at all sampling sites. Hap3 （6.3%） was distributed in Dayu and Chongyi. Hap2 （2%） was observed only in Xingguo. The singleline haplotype network model， the small and insignificant Harpendings raggedness （HR） index and the unimodal mismatch distribution curve indicated that D.citri populations in Jiangxi had the recent invasion and rapid dynamic expansion.

Key words Diaphorina citri; huanglongbing; population genetic structure; COⅠ gene; Jiangxi

亞洲柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama（半翅目Hemiptera，扁木虱科Liviidae）是熱帶和亞熱帶地區(qū)柑橘的主要害蟲，其成蟲主要以嫩葉及未成熟莖的韌皮部為食，有時(shí)也會(huì)吸食寄主植物的老葉[12]。它能夠傳播韌皮部桿菌屬的病原體Candidatus Liberibacter spp.，導(dǎo)致柑橘黃龍病huanglongbing，后者被認(rèn)為是柑橘上最嚴(yán)重的病害之一[3]。亞洲柑橘木虱最早于1907年在我國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)[4]，現(xiàn)已廣泛分布于整個(gè)亞洲、中東地區(qū)、美國(guó)南部、加勒比群島以及南美洲各地[57]。該蟲自20世紀(jì)初入侵我國(guó)后，已在廣西、廣東、福建、江西等地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生[8]，并逐步入侵到我國(guó)長(zhǎng)江以南各?。▍^(qū)），目前隨全球氣候變暖，正繼續(xù)向北方擴(kuò)散。亞洲柑橘木虱的入侵促進(jìn)了柑橘黃龍病在江西省的擴(kuò)散蔓延，給該地區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。

遺傳結(jié)構(gòu)是指等位基因或基因型在時(shí)間或空間上的非隨機(jī)分布。研究種群的遺傳結(jié)構(gòu)可以估計(jì)種群的遺傳多樣性和種群間的基因交流，推斷祖先種群和種群的遺傳分化水平。這些信息對(duì)于害蟲的綜合管理至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)對(duì)亞洲柑橘木虱的研究主要側(cè)重于它的宏觀生物學(xué)及生態(tài)學(xué)特性，如生活史、耐熱性、耐寒性、傳菌性，以及光、溫濕度等對(duì)其發(fā)育繁殖與存活的影響;對(duì)其田間種群的發(fā)生和防控等方面也有詳細(xì)報(bào)道[1]。然而，迄今為止對(duì)該害蟲種群遺傳學(xué)等微觀方面缺乏研究。

不同地區(qū)的溫度、濕度、寄主植物和人類活動(dòng)等環(huán)境因子對(duì)亞洲柑橘木虱的存活和繁殖有顯著影響[912]。亞洲柑橘木虱的高繁殖量和短繁殖周期（2～7周），使其在入侵后對(duì)新環(huán)境有迅速的反應(yīng)。入侵種群將獲得不同的生態(tài)學(xué)特性，例如在寄主偏好、求偶行為、發(fā)育時(shí)間、致病性、對(duì)天敵和農(nóng)藥的敏感性，以及耐熱性等方面發(fā)生改變[1316]，并分化形成不同的地理種群。目前國(guó)外學(xué)者在探討局部地區(qū)亞洲柑橘木虱的種群遺傳結(jié)構(gòu)及其分化等方面已取得許多重要的研究成果[1720]。

線粒體COⅠ基因包含豐富的遺傳信息，進(jìn)化速率適中，可作為種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記[2122]。為了了解江西亞洲柑橘木虱的種群遺傳結(jié)構(gòu)，筆者測(cè)定了該地區(qū)不同地理種群的COⅠ基因片段序列，分析其種群遺傳多樣性及地理分化，為江西亞洲柑橘木虱及黃龍病的防控提供重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 樣本收集、測(cè)序和序列分析

從江西瑞金（25.796°N，115.969°E）、龍南（24.901°N，114.769°E）、石城（26.427°N，116.278°E）、興國(guó)（26.275°N，115.343°E）、崇義A（25.552°N，114.281°E）、崇義B（25.612°N，114.289°E）、尋烏（24.961°N，115.661°E）、大余A（25.447°N，114.452°E）、大余B（25.442°N，114.446°E）和章貢（25.799°N，114.889°E）等10個(gè)取樣點(diǎn)，采集到48頭亞洲柑橘木虱成蟲，放入95%乙醇并保存在-20℃冰箱中，用于測(cè)序和種群遺傳學(xué)分析。采用試劑盒TIANamp Micro DNA Kit（TIANGEN Biotech Co.， Ltd）提取單個(gè)樣本的總基因組DNA，具體操作步驟見說明書。采用2對(duì)引物擴(kuò)增COⅠ基因片段序列（表1）。反應(yīng)體系選用寶生物工程 （大連） 有限公司的試劑盒： 1 μL的10 mmol/L dNTPs，1.5 μL的15 μmol/L引物，4 μL的25 mmol/L MgCl2，5 μL的10×Buffer，0.6 μL的5U TaqDNA聚合酶，1 μL的20 ng/μL的基因組DNA模板，ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)總體積到50 μL。PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler pro S梯度PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;之后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，45～56℃退火45 s;72℃延伸1 min，共運(yùn)行40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸3 min。所有PCR產(chǎn)物直接送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序，測(cè)序引物見表1。

用SEQUENCHER ver. 4.1.2（Gene Codes Corporation， Ann Arbor， MI）和BioEdit[23]軟件核查和編輯DNA序列。所有序列都用CLUSTALW和 MAFFT ver.5[24]軟件進(jìn)行比對(duì)。應(yīng)用DnaSP ver.5.10軟件[25]獲取序列單倍型和多態(tài)性位點(diǎn)。所有序列上傳至GenBank（登錄號(hào)：MK804797～MK804890）。

1.2 單倍型網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)及種群歷史動(dòng)態(tài)分析

為了比較江西不同地理種群之間的遺傳學(xué)關(guān)系，本文利用PopART （http：∥popart.otago.ac.nz）軟件構(gòu)建亞洲柑橘木虱COⅠ序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模式。為了推算其種群動(dòng)態(tài)歷史，我們利用Arlequin ver. 3.5軟件中的錯(cuò)配分布分析檢驗(yàn)該害蟲種群在江西地區(qū)是否經(jīng)歷近期的擴(kuò)張事件。錯(cuò)配分布是以可視化方式體現(xiàn)群體歷史動(dòng)態(tài)的方法。一般來說，動(dòng)態(tài)平衡的種群錯(cuò)配分布分析呈現(xiàn)多個(gè)峰形，而經(jīng)歷近期擴(kuò)張的種群錯(cuò)配分布分析呈現(xiàn)單個(gè)峰形[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍型和遺傳變異

從10個(gè)采集點(diǎn)的48頭亞洲柑橘木虱中擴(kuò)增到2個(gè)線粒體COⅠ基因片段（COⅠ1和COⅠ2，長(zhǎng)度分別為760 bp和671 bp），總長(zhǎng)度為1 431 bp。分析所有序列時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（均為非同義突變，A/G轉(zhuǎn)換）和3個(gè)單倍型（Hap1，Hap2和Hap3，表2）。其中Hap1最常見（占總樣本數(shù)的91.7%），入侵所有采集點(diǎn);其次為Hap3（占6.3%），分布在大余A和B以及崇義A;Hap2（占2%）僅在興國(guó)出現(xiàn)（表3）。

2.2 種群遺傳關(guān)系

江西亞洲柑橘木虱的單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為單一直線型模式（圖1）。Hap1均衡地分布在所有采集區(qū)域，為祖先單倍型;出現(xiàn)在興國(guó)的單倍型Hap2是由祖先單倍型Hap1經(jīng)一次突變形成;來自大余和崇義的單倍型Hap3則由Hap2經(jīng)一次突變產(chǎn)生。

2.3 種群動(dòng)態(tài)歷史

錯(cuò)配分布分析結(jié)果見圖2。單峰型分布模式，以及小而不顯著的HR（Harpendings raggedness）指數(shù)值（P>0.05）（圖2）表明：亞洲柑橘木虱種群在近期入侵江西，并經(jīng)歷迅速的動(dòng)態(tài)擴(kuò)張[26]或因相鄰地區(qū)間存在高的種群遷移水平而形成區(qū)域擴(kuò)張[2728]。最低的核苷酸突變（如0和1）發(fā)生頻率高（圖2）同樣暗示：該地區(qū)的亞洲柑橘木虱種群是由少數(shù)祖先個(gè)體通過近期擴(kuò)張形成。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模式（圖1）也證實(shí)該害蟲在入侵江西后經(jīng)歷快速的種群擴(kuò)散過程。

3 討論

江西省是我國(guó)重要的柑橘產(chǎn)地，生產(chǎn)的臍橙、蜜橘、柚類享譽(yù)海內(nèi)外。20世紀(jì)70年代末，亞洲柑橘木虱入侵贛州地區(qū)，進(jìn)而引發(fā)黃龍病[29]。此后由于該省柑橘栽培區(qū)冬季氣溫轉(zhuǎn)暖，木虱種群變大，其地理分布明顯北移，發(fā)生范圍進(jìn)一步擴(kuò)大。本研究擴(kuò)增了江西10個(gè)地點(diǎn)亞洲柑橘木虱的2個(gè)線粒體COⅠ基因序列片段，總長(zhǎng)度達(dá)到1 431 bp，但分析所有序列后僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，且都為非同義突變類型（A/G轉(zhuǎn)換）。這種低的遺傳變異現(xiàn)象說明該害蟲在江西地區(qū)經(jīng)歷了最近的入侵事件，并且可能是單個(gè)單倍型的入侵。其3個(gè)單倍型（Hap1，Hap2和Hap3）在不同地區(qū)出現(xiàn)的頻率不同。在瑞金、龍南、石城、尋烏和章貢只發(fā)現(xiàn)一個(gè)單倍型（Hap1），可能意味著這些種群在入侵后由于繁殖體數(shù)目小和瓶頸效應(yīng)，它們還在繼續(xù)維持這個(gè)祖先單倍型。而興國(guó)除了具有祖先單倍型外，由于少數(shù)個(gè)體發(fā)生點(diǎn)突變，形成一個(gè)新的單倍型（Hap2）;崇義和大余在該突變之后再次發(fā)生點(diǎn)突變，又增加了一個(gè)單倍型（Hap3），因而這些地區(qū)的柑橘木虱顯示出相對(duì)較高的遺傳多態(tài)性。這可能是由于多次入侵和/或在一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的擴(kuò)張歷史過程中，由于棲息地環(huán)境的改變（如柑橘種植地大量使用殺蟲劑或地區(qū)性氣候劇烈變化等）導(dǎo)致基因發(fā)生突變。目前在伊朗、巴基斯坦、巴西、美國(guó)等地也有關(guān)于亞洲柑橘木虱遺傳多樣性的報(bào)道[1620]，且使用與本文相同的分子標(biāo)記（COⅠ1），但采樣區(qū)域、所分析樣本的數(shù)量，以及COⅠ序列片段的長(zhǎng)度不同。本文增加了一個(gè)用于遺傳結(jié)構(gòu)分析的COⅠ基因片段（COⅠ2），從而獲得了更多的序列變異信息。在本研究中，亞洲柑橘木虱的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及錯(cuò)配分布分析結(jié)果都表明，該害蟲在近期入侵江西地區(qū)，并且經(jīng)歷了快速的種群動(dòng)態(tài)擴(kuò)張。然而我們并不清楚江西亞洲柑橘木虱的來源及與全國(guó)其他省份有著怎樣的遺傳學(xué)關(guān)系;對(duì)全國(guó)各地入侵種群的遺傳變異規(guī)律和分化格局等還有待深入研究。

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