王軍節(jié),李貞彪,張懷予,王 鵬,范春霞,陳善貴,崔美麗,鄧淑芳,趙魯迺克

(1.北方民族大學植物性農產品貯藏與加工重點實驗室,寧夏銀川 750021;2.北方民族大學生物科學與工程學院,寧夏銀川 750021;3.江西楓樹食品生態(tài)科技有限公司,江西宜春 330700)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)果實因富含營養(yǎng)和活性成分而成為理想藥食資源,在國內外市場享有盛譽[1-3]。目前,該果主要以干制、榨汁和釀酒等加工產品進行商業(yè)化流通,但加工過程會造成其營養(yǎng)和活性成分損失[4-6]。隨著消費者對天然且新鮮果品的日益追求,其活性成分得以最大程度保留的鮮果市場份額將日益增大[7-8]。

枸杞漿果小而多汁,組織極易遭受真菌侵染而腐爛變質[9-10]。鏈格孢是引起枸杞霉變的主要病原菌[11-12],因其具有潛伏侵染和耐低溫能力已成為鮮果冷鏈物流中主要問題[13-14]。雖然殺菌劑戴挫霉可有效控制枸杞鮮果采后病害,但存在環(huán)境污染、食品安全和抗藥性等問題,因此開發(fā)新型安全控制防腐措施十分必要[15]。

植物精油是植物體內具有較強揮發(fā)性的次生代謝產物,具有明顯的抑菌活性、低毒且對環(huán)境影響小,已被證明是一種具有控制采后病害潛力的安全措施[16]。這其中,香芹酚(2-甲基-5-異丙基苯酚)是一種來自牛至和百里香等植物精油,因其天然安全和良好抑菌活性，在美國和歐洲被批準為食品添加劑[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),香芹酚能控制炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、根霉(Rhizopusstolonifer)和曲霉(Aspergillusflavus)等病原引起的荔枝炭疽病[19]、桃軟腐病[20]和櫻桃番茄[21]腐爛等采后病害。然而,有關香芹酚對鏈格孢菌的直接作用以及對枸杞黑霉病抑制效果的研究鮮有報道。

本試驗以鏈格孢菌為研究對象,通過體外分析香芹酚對其菌絲擴展、孢子萌發(fā)和超微結構的影響,并調查香芹酚對寧夏枸杞鮮果黑霉病發(fā)病率和病斑擴展抑制效果,以及分析測定處理后果實體內過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性,以期探明香芹酚控制枸杞黑霉病效果和初步機制,旨在為香芹酚控制寧夏枸杞采后黑霉病機制提供依據(jù),也為開發(fā)枸杞采后綠色安全防腐劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧杞5號(LyciumbarbarumL.cv.Ningqi 5) 分別于2017年7月和2018年9月購于寧夏農林科學院枸杞研究所,挑選無病蟲害、大小均一的鮮果;鏈格孢菌(Alternariaalternata) 從采后枸杞自然發(fā)生黑霉病害部位中分離而得;葡萄糖、瓊脂粉等 分析純,均購于天津市大茂化學試劑廠;香芹酚 純度為98.0%,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股分有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 中國哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;BA210-T生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司;S-3400N掃描式電子顯微鏡 日本日立高新技術有限公司;UV-9000S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;H2100R高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香芹酚處理對鏈格孢菌體外抑制效果測定

1.2.1.1 病原菌的分離及純化 采集有黑霉病癥狀的枸杞果實,用75%乙醇進行果實表面消毒,再用無菌水沖洗后切取病健交界處的組織,在無菌條件下移至馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上,然后置于28 ℃保溫培養(yǎng),待其長出分生孢子后再進行單孢子純化,并通過回接試驗確定其致病性[22]。分離純化的病原物在馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 香芹酚對鏈格孢菌絲生長的影響 參照Yao等[23]的方法并作改進。將濃度分別為0、0.5、1、2、4和8 μL/L的香芹酚加入已滅菌并冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基中。再打取0.5 cm的鏈格孢菌菌餅接種在凝固后的培養(yǎng)基中心,于28 ℃避光條件培養(yǎng)7 d后,用十字交叉法測量菌落直徑,每個處理3次重復。

1.2.1.3 香芹酚對孢子萌發(fā)的影響 參照Liu等[24]方法并修改。香芹酚分別加入含4 mL PDB培養(yǎng)基的試管中,使其最終濃度分別為0、1、2、4和8 μL/L,再加入400 μL 振蕩均勻的濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液,于28 ℃培養(yǎng)。每隔4 h用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況,每次觀察至少200個孢子,重復3次。

1.2.1.4 香芹酚對菌落形態(tài)及菌絲超微結構的影響 參照吳靜等[25]方法并做修改。取抑制效果最佳的含藥物PDA平板及對照組菌餅(3.0 mm×3.0 mm)若干,用體積分數(shù)為2% 的戊二醛在4 ℃冰箱中固定2 h后,換用0.1 mol/L二甲砷酸鈉緩沖液浸泡3次,每次間隔2 h;后固定階段,除去菌餅中的緩沖液,加入體積分數(shù)為1%鋨酸溶液將菌絲表面覆蓋,浸泡2 h,固定階段在4 ℃下進行。脫水處理階段,用體積分數(shù)為30%、50%、70%(4 ℃條件下進行)、80%、90%(室溫下進行)的系列乙醇脫水,每次10 min,再用100%乙醇脫水2次,每次15 min。75%的叔丁醇置換20 min后放置于-20 ℃冰箱中30 min。最后樣品用臨界點干燥器干燥。制好的掃描電鏡標本在S-3400N掃描式電子顯微鏡下觀察并在相同倍數(shù)下收集對照組和處理組的照片。

1.2.2 香芹酚處理對果實抗病性的影響

1.2.2.1 枸杞的熏蒸處理 選擇大小、果色均勻一致、無傷無病、未經處理的枸杞果實,用75%乙醇擦拭果實表面消毒并晾干酒精,將80個左右的枸杞鮮果放入聚苯乙烯盒(PE)中,在盒蓋子中心用透明膠帶貼一張濾紙,并在蓋子中心打直徑為2 mm左右的小孔,按0、1、2、4和8 μL/L濃度梯度從不同盒子的小孔分別加香芹酚溶液到濾紙上,立即將小孔和蓋子完全密封熏蒸處理24 h,處理結束打開蓋子平衡6 h[26]。處理果實于PE保鮮盒中在(25±2) ℃、RH 85%～95%條件下貯藏待用。

1.2.2.2 香芹酚處理對枸杞果實黑霉病的控制 取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的鏈格孢菌,用無菌蒸餾水配制濃度為1×106個/mL孢子懸浮液[27]。用75%乙醇擦拭枸杞果實表面消毒,接種針經酒精燈火焰滅菌并晾涼,取出香芹酚熏蒸處理24 h后的枸杞果實,在每個果實赤道部位刺1 mm大小均勻的孔,并在孔內接種2 μL孢子懸浮液,晾干后果實放入PE保鮮盒中并置于(25±2) ℃、RH 85%～95%貯藏。按下式計算發(fā)病率;用游標卡尺進行十字交叉法測量病斑直徑,并計算病斑面積,每個處理重復3次。

1.2.2.3 POD和PAL酶活性測定 分別取室溫貯藏0、1、2、3、4、5 d各個處理果實進行酶活測定樣品制備。首先將枸杞籽去除,然后將果肉組織混勻并用錫箔紙包裹,液氮速凍后在-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。每個時間點每處理用果30個,重復3次。

POD活性測定:參照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉組織,加3 mL pH7.5的50 mmol/L磷酸提取緩沖液(內含4% PVP(W/V),1 mmol/L聚乙二醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.01% TritonX-100(V/V)),冰浴條件下研磨成勻漿,4 ℃ 15000×g條件下離心20 min,取上清液為粗酶液。POD酶活反應體系為:2.7 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、50 μL粗酶提取液和250 μL 250 mmol/L H2O2,分別加入后迅速混合,記錄反應體系在波長470 nm處的吸光度,觀察3 min內吸光度的變化并每隔1 min記錄1次吸光度。酶活以每分鐘內OD470變化為1個活力單位U,活性表示為每克鮮重果肉組織活性,即為U/g FW,每樣品重復測3次。

PAL活性測定:參照Wang等[28]方法并修改。取3.0 g果肉組織,加入3 mL 0.1 mol/L的硼酸緩沖液(pH8.8,內含10% PVP(W/V),1 mmol/L EDTA 和50 mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴條件下充分研磨,然后于4 ℃ 15000×g條件下離心30 min,收集上清液并立即用于酶活性測定。PAL酶活性反應體系為:2.7 mL 7 mmol/L底物混合液(L-苯丙氨酸用硼酸緩沖液配置),20 μL粗酶液,30 ℃下反應30 min,立即加入200 μL 6 mol/L HCl終止反應。在290 nm處測定吸光度值,酶活以每分鐘內OD290變化為1個活力單位U,活性表示每克鮮重果肉組織活性,即為U/g FW,每樣品重復測3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理,計算標準偏差或進行Duncan’s多重差異顯著性分析,p<0.05時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 香芹酚處理對鏈格孢菌的體外抑制效果

2.1.1 香芹酚對鏈格孢菌菌絲生長的影響 香芹酚處理對鏈格孢菌菌落直徑擴展的影響如圖1所示。由圖可知,不同濃度香芹酚處理均能顯著抑制菌落直徑擴展,菌落直徑隨著香芹酚濃度增加而減小,其中0.5和1 μL/L濃度處理后菌落直徑無顯著差異,而8 μL/L濃度處理菌落直徑為1.6 cm,僅為對照的19.19%。因此,8 μL/L對鏈格孢菌菌落生長抑制效果最佳。

圖1 香芹酚處理對鏈格孢菌落直徑擴展的影響

2.1.2 香芹酚對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響 香芹酚處理對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響如圖2所示。由圖可知,鏈格孢孢子萌發(fā)率隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加,香芹酚處理后鏈格孢的孢子萌發(fā)率在各時間段內均顯著低于對照,且濃度越大,抑制效果越明顯,但低濃度香芹酚(<4 μL/L)處理鏈格孢的孢子萌發(fā)抑制效果不明顯。而在16 h時,8 μL/L高濃度香芹酚處理組其孢子萌發(fā)率僅為38.5%,顯著低于對照組的萌發(fā)率(89.9%)(p<0.05)。因此,8 μL/L對鏈格孢菌孢子萌發(fā)抑制效果最好。

圖2 香芹酚處理對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響

2.1.3 香芹酚對鏈格孢菌菌絲和孢子形態(tài)超微結構的影響 香芹酚處理對鏈格孢菌菌絲和孢子形態(tài)超微結構的影響如圖3所示。由圖可知,在500倍掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對照組的菌絲粗細均勻,沒有出現(xiàn)不規(guī)則分支、塌陷等現(xiàn)象(圖3A),香芹酚處理過的鏈格孢菌絲量較少,表面粗糙,出現(xiàn)不規(guī)則分支,粗細不均勻,折疊扭曲盤繞,部分出現(xiàn)塌陷變形現(xiàn)象(圖3B)。在5000倍掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)處理組的孢子數(shù)量較對照組稀疏(圖3C、圖3D),處理組孢子表面有白色粒狀物且細胞腫脹變形(圖3D)。

圖3 香芹酚對鏈格孢菌絲和孢子形態(tài)超微結構的影響

2.2 香芹酚處理對果實抗病性的影響

2.2.1 香芹酚處理對枸杞果實黑霉病發(fā)病率和病斑面積的影響 不同濃度的香芹酚處理枸杞果實后損傷接種A.alternata,發(fā)病率和病斑面積均隨著貯藏時間延長而增加(圖4)。4 μL/L能顯著抑制2 d后黑霉病的發(fā)病率,該濃度處理后2、3、4 d的發(fā)病率分別比同期對照低33.3%、60%和39.99%(圖4A)。接種第4 d僅4 μL/L的香芹酚處理顯著抑制了病斑的擴展,隨著時間延長,其它濃度香芹酚處理也能顯著抑制病斑面積擴展,其中以4 μL/L效果最佳(圖4B)。

圖4 香芹酚處理對枸杞果實損傷接種黑霉病發(fā)病率(A)和病斑面積(B)的影響

2.2.2 香芹酚處理對果實過氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性的影響 香芹酚處理對枸杞果實POD和PAL活性的影響如圖5所示。枸杞果實短期貯藏期間POD活性呈先降低后略有升高趨勢,各個濃度香芹酚處理均能提高短期貯藏(2～5 d)POD活性,其中4 μL/L效果最明顯(圖5A),該濃度香芹酚處理后果實第2、3、4、5 d的POD活性分別為同期對照的2.24、1.55、2.09和1.55倍(圖5A)。PAL在短期貯藏期間呈先略有降低再略有升高趨勢,4 μL/L在處理2 d后的各個階段均顯著高于對照,其中第3、4、5 d最明顯,分別比同期對照高33.34%、52.04%和27.41%(圖5B)。

圖5 香芹酚處理對枸杞果實POD(A)和PAL(B)活性的影響

3 討論與結論

本研究體外試驗結果發(fā)現(xiàn):不同濃度香芹酚對鏈格孢菌的體外抑制效果存在濃度依賴效應。該結果與王新偉等[29]研究香芹酚對黑曲霉、胡珊等[19]研究香芹酚等多種精油對荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、以及Pérez-Alfonso等[30]研究香芹酚對青霉(Penicilliumitalicium)作用效果基本一致。電鏡觀察結果表明:香芹酚對鏈格孢菌絲和孢子形態(tài)超微結構產生了破壞作用,由此推測香芹酚可能是通過改變菌絲體及孢子的細胞膜和細胞壁等細胞器的形態(tài)結構,造成細胞不可逆損傷,最終導致微生物死亡[31];或者是通過影響病原菌的細胞代謝從而來抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)[32-33];此外,香芹酚是一種酚類化合物,酚可以與膜蛋白相互作用,這可能導致膜結構和功能的變形[32],而膜的變形和功能障礙可干擾真菌細胞內ATP的產生,主要抑制ATP產生的酶和底物使用[34-35],最終表現(xiàn)出對病原真菌很強的抑制能力。

香芹酚處理能夠抑制損傷接種果實的發(fā)病率和病斑面積的擴展,并且對黑霉病控制與誘導果實POD和PAL活性相關。POD 是植物體內重要的抗氧化酶,在植物抵抗病原菌中發(fā)揮重要作用,可以通過催化H2O2和酚類物質聚合增強結構抗性[27]。PAL為苯丙烷代謝途徑中的第一關鍵酶,參與酚類、植保素和木質素等抗菌物質的合成來提高植物的防衛(wèi)反應[36-37]。因此,香芹酚處理枸杞提高了果實POD和PAL活性有利于其抵抗黑霉病。汪開拓等[38]研究表明茉莉酸甲酯(MeJA)處理可顯著抑制葡萄果實在貯藏期間腐爛率和失重率的上升,同時可顯著誘導植保素合成相關酶的活性來提高果實抗病性。潘磊慶等[39]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油可有效抑制灰葡萄孢及匍枝根霉的生長,并誘導櫻桃番茄防御性酶POD活性的升高。王雙輝等[40]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚浸泡處理能顯著降低楊梅果實的腐爛程度,表現(xiàn)出良好的抑菌效果。由此可知,香芹酚不但具有對病原菌直接治愈效果,還能通過誘導抗病性起到預防目的,具有控制枸杞鮮果采后黑霉病潛力。但有關香芹酚的直接抑菌和誘導抗性的深層機理尚有待進一步研究。