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利用芯片毛細管電泳檢測技術(shù)鑒定玉米種子純度的研究

2019-06-25 02:28曹士亮張建國扈光輝王成波曹靖生劉寶民
中國種業(yè) 2019年6期
關(guān)鍵詞:先玉毛細管雜交種

于 滔 曹士亮 張建國 扈光輝 王成波 曹靖生 劉寶民

(1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站,哈爾濱 150086;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所,哈爾濱150086;3農(nóng)業(yè)部東北北部玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,哈爾濱150086)

玉米(Zea mays L.)是我國第一大糧食作物,2016年總產(chǎn)量高達2.2億t。近年來,隨著我國種業(yè)市場的快速發(fā)展,玉米種子作為我國種業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)品,其雜交種質(zhì)量的好壞直接影響玉米大田生產(chǎn)、新品種市場規(guī)模、種子企業(yè)及農(nóng)民的經(jīng)濟效益[1],玉米種子純度鑒定也已經(jīng)成為種子質(zhì)量檢測的核心指標。因此,加強玉米種子純度鑒定的標準化對于保證種子質(zhì)量、保護農(nóng)民利益、維護育種家權(quán)益等具有非常重要的現(xiàn)實意義[2]。目前,玉米種子純度鑒定已由傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定技術(shù)發(fā)展到分子標記鑒定技術(shù)[3],其中,SSR檢測技術(shù)因具有操作簡單、重復(fù)性好、多態(tài)性高和技術(shù)成熟等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于玉米種子純度鑒定[4]。芯片毛細管電泳是在芯片上進行的毛細管電泳,通過以高壓直流電場為驅(qū)動力,使待測樣品在經(jīng)過玻璃、石英或各種聚合物材料制成的微米級通道時進行高效分離及檢測,與傳統(tǒng)毛細管電泳相比,芯片毛細管電泳具備耗時短、通量高、系統(tǒng)體積小且易實現(xiàn)不同操作單元的集成等優(yōu)點[5]。本研究將SSR檢測技術(shù)與芯片毛細管電泳相結(jié)合,應(yīng)用于具有代表性的玉米品種先玉335和鄭單958的純度鑒定,為我國今后的玉米種子質(zhì)量鑒定和種業(yè)市場監(jiān)管提供方案支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料共6份,為雜交種先玉335及其親本自交系PH6WC、PH4CV和鄭單958及其親本自交系鄭58和昌7-2,研究所用玉米種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所保存且均為隨機抽樣所得。

1.2 供試材料基因組DNA提取 參考植物基因組DNA提取試劑盒(天根DP305)說明書分別提取供試材料葉片DNA,應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳及超微量分光光度計(IMPLEN NanoPhotometer P-class)檢測玉米葉片DNA質(zhì)量及濃度。

1.3 SSR引物篩選 選擇農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NYT1432-2007玉米品種鑒定DNA指紋方法中20對基本核心引物其中的10對引物用于區(qū)分雜交種的父母本,引物由上海生工生物工程有限公司合成,具體信息見表1。PCR反應(yīng)體系為20μL,包括DNA模板(50ng/μL)4.0μL,2×Mix 10.0μL,Left primer(10μmol/L)0.2μL,Right primer(10μmol/L)0.2μL,ddH2O 5.6μL。PCR 反應(yīng)程序為,94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 40s,60℃退火 35s,72℃延伸 45s,共進行35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)5%瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選親本間存在多態(tài)性SSR引物,染色采用EB替代物GelRed。

1.4 玉米種子純度鑒定 選用親本間多態(tài)性SSR引物分別對雜交種及其父本、母本進行PCR擴增,按照LabChip GX Touch DNA 1K芯片說明書對PCR產(chǎn)物進行芯片毛細管電泳,使用LabChip GX Touch分析軟件對獲取的數(shù)據(jù)進行分析,并計算玉米種子純度=雜交種子數(shù)/檢測種子總量×100%。

表1 10對引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料DNA的質(zhì)量檢測 應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的先玉335、鄭單958、PH6WC、PH4CV、鄭58和昌7-2葉片DNA質(zhì)量,結(jié)果如圖1所示,DNA條帶清晰無拖尾,說明所提取的DNA無降解,質(zhì)量較高。采用超微量分光光度計測量玉米葉片DNA純度,結(jié)果顯示所提DNA樣品 OD260/OD280比值均在 1.9~2.0 之間,說明本研究所制備的DNA純度符合試驗要求,可以用于后續(xù)研究。

2.2 SSR引物篩選 選擇國準NYT1432-2007基本核心引物中的10對SSR引物分別對PH6WC、PH4CV、鄭58、昌7-2 4份玉米自交系材料進行PCR擴增篩選親本間多態(tài)性引物,SSR引物篩選原則為該引物在父母本中的擴增產(chǎn)物大小差異明顯,且電泳條帶盡量單一、清晰。5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測,結(jié)果見圖2、圖3,根據(jù)引物篩選原則,選出適用于檢測雜交種先玉335的SSR引物為umc2105、bnlg2291,適用于檢測雜交種鄭單958的SSR引物為bnlg2291、bnlg161,鑒于bnlg2291引物在2組供試材料中均有較好的多態(tài)性,最終選擇bnlg2291引物用于后續(xù)研究。

圖1 玉米基因組DNA電泳檢測結(jié)果

圖2 PH6WC、PH4CV SSR引物篩選結(jié)果

圖3 鄭58、昌7-2 SSR引物篩選結(jié)果

2.3 供試材料的純度鑒定結(jié)果 選用SSR引物bnlg2291分別擴增6份供試材料,其中雜交種先玉335和鄭單958各單獨提取94份葉片DNA用于PCR擴增,對PCR產(chǎn)物進行芯片毛細管電泳,并對獲取的數(shù)據(jù)進行分析,若所獲得的峰圖為雙峰且均與bnlg2291引物在其父母本中篩選的峰值一致,則認定為雜交種;若所獲得的峰圖為雙峰且只有1個峰值與bnlg2291引物在父母本中的峰值一致,則認定為異交種;若所獲得的峰圖為雙峰但雙峰均與bnlg2291引物在父母本中的峰值不一致,則認定為雜株;若所獲得的峰圖為單峰且峰值與bnlg2291引物在父母本中的1個峰值一致,則認定為自交種。部分鑒定結(jié)果如圖4、圖5,玉米雜交種先玉335的純度為(94-2)/94×100%=97.87%,玉米雜交種鄭單958 的純度為(94-1)/94×100%=98.94%。

圖4 先玉335及其親本自交系芯片毛細管電泳純度鑒定部分結(jié)果

圖5 鄭單958及其親本自交系芯片毛細管電泳純度鑒定部分結(jié)果

3 結(jié)論與討論

SSR分子標記基序一般為1~6bp[6],玉米基因組中含有大量的SSR多態(tài)性標記,利用SSR分子標記鑒定玉米種子純度,易于區(qū)分雜交種、自交種、異交種和雜株。但由于不同玉米品種間的純度鑒定引物存在差異,所以玉米種子純度鑒定前首先要篩選在雜交種雙親間存在多態(tài)性的SSR引物,通常選擇1對引物或2對以上引物組合[7-8]。在本研究中,采用5%瓊脂糖凝膠電泳檢測SSR引物篩選結(jié)果,該方法分辨率雖然較聚丙烯酰胺凝膠電泳稍低,但能夠清楚區(qū)分差異大小20bp左右的片段,且操作簡單,大大降低試驗成本及耗時,同時應(yīng)用無毒的EB替代物對環(huán)境及操作人員無危害。

芯片毛細管電泳原理基于微流體技術(shù),分辨率可以達到1bp。與傳統(tǒng)毛細管電泳相比,芯片毛細管電泳所需樣品量低于1μL檢測靈敏度能夠達到5pg/μL,樣品分析時間可短至42s,通量提高70倍,而且分離檢測過程全部由儀器自動來完成,無人工介入,無交叉污染。與熒光標記毛細管電泳相比,芯片毛細管電泳引物不需要熒光標記,且可用的引物范圍較廣,適用于絕大多數(shù)SSR引物,因此試驗成本更經(jīng)濟。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比,芯片毛細管電泳根據(jù)峰值獲得的數(shù)值化數(shù)據(jù)更精確,后期數(shù)據(jù)分析更簡便,操作過程簡單,且通量高,全程無毒無害。

本研究選用玉米雜交種先玉335、鄭單958及其親本自交系PH6WC、PH4CV、鄭58和昌7-2作為試驗材料,采用SSR檢測技術(shù)結(jié)合芯片毛細管電泳檢測技術(shù),篩選出適用于鑒定先玉335和鄭單958種子純度的引物3對,應(yīng)用bnlg2291引物鑒定先玉335和鄭單958的純度分別為97.87%及98.94%。研究結(jié)果建立一套簡單、經(jīng)濟、高效、安全的玉米種子純度鑒定方法,為完善玉米種子純度快速鑒定方法提供參考。

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