向陽

摘 ?要：近年來，隨著抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究的進(jìn)一步發(fā)展，世界各地實(shí)驗(yàn)室在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究方面均有收獲，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻檢測隨之成為眾多科學(xué)家的關(guān)注點(diǎn)。該文綜述了抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻檢測技術(shù)的研究進(jìn)展，為進(jìn)一步開展轉(zhuǎn)基因水稻檢測的研究工作提供參考。

關(guān)鍵詞：抗蟲 Tail-PCR;轉(zhuǎn)基因水稻;基因芯片;檢測技術(shù)

中圖分類號 ?S511文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）10-0015-04

稻米是全世界近一半人口消費(fèi)的主要糧食作物，對于人類的生存和發(fā)展起著極其重要的作用，是我國食用人口比重最大的糧食作物。研究表明，當(dāng)前制約水稻穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)以及稻米品質(zhì)的主要是各類害蟲，所以防治蟲害成為了重中之重。在防治害蟲時，使用生物防治手段，不僅制約因素多、還不易控制，而使用化學(xué)農(nóng)藥不僅破壞生態(tài)平衡、還可以使螟蟲產(chǎn)生抗性;培育抗蟲水稻新品種，增強(qiáng)水稻的抗蟲性，是一種更經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法。然而，傳統(tǒng)的抗蟲水稻育種周期長，有限的遺傳資源，不明確的抗蟲機(jī)制，還會產(chǎn)生新的生物型害蟲，導(dǎo)致抗蟲性不穩(wěn)定，極大地制約了水稻抗蟲育種的進(jìn)程。因此，利用基因工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻，是水稻防蟲侵害的最有希望和前途的方法。

1 抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻簡介

抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻就是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗蟲基因?qū)胨镜氖荏w細(xì)胞中，使寄主在水稻細(xì)胞內(nèi)抗蟲基因得到表達(dá)并遺傳，使水稻自身產(chǎn)生抗蟲蛋白，進(jìn)而形成抗蟲的新型水稻品種。在水稻轉(zhuǎn)基因抗蟲研究中，被廣泛應(yīng)用的水稻抗蟲基因是從蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中發(fā)現(xiàn)的Bt基因。1989年，人類第一次培育轉(zhuǎn)基因水稻植株，此植株是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊虹等將Bt基因利用原生質(zhì)體電融合技術(shù)導(dǎo)入粳稻臺北309的基因組DNA中培育出的新型水稻[1]?，F(xiàn)至今已有多個實(shí)驗(yàn)室成功培育出轉(zhuǎn)基因水稻新品種。金永梅等[2]將 Cry1C*、 Cry2A*這2個不同的Bt抗蟲基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法同時導(dǎo)入到水稻品種吉粳88中去，獲得了二價抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻。2005年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)院士課題組，將水稻Actin啟動子驅(qū)動的融合型Bt抗蟲基因cry1A（b）/cry1A（c）導(dǎo)入秈型恢復(fù)63中，得到了一些基本不用藥物防治螟蟲危害的轉(zhuǎn)化植株[3]。2009年底，2個由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”，首次獲得農(nóng)業(yè)部為轉(zhuǎn)基因水稻頒發(fā)的安全證書，標(biāo)志著轉(zhuǎn)Bt基因水稻以成功進(jìn)入中國。2015年1月5日，“轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“再次獲得由農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（生產(chǎn)應(yīng)用），2018年，轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻華恢1號獲得美國FDA的商業(yè)化許可。2002年，我國農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部同時發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》、《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》2部法規(guī)，內(nèi)容規(guī)定強(qiáng)制進(jìn)行轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識[4-5]。表明抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的培育和應(yīng)用需要轉(zhuǎn)基因水稻的檢測技術(shù)。就轉(zhuǎn)基因基因檢測技術(shù)來說，發(fā)達(dá)國家技術(shù)水平高于發(fā)展中國家，美國等發(fā)達(dá)國家向發(fā)展中國家出口了大量抗蟲轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。中國已經(jīng)加入了WTO，必然面臨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易和安全監(jiān)控的挑戰(zhàn)[6-8]。

2 抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻檢測技術(shù)研究進(jìn)展

抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻檢測主要內(nèi)容是檢測抗蟲基因（Bt基因）是否存在以及含量，還要確定其是否能成為合格的轉(zhuǎn)基因新品種等[9]。隨著科技的不斷發(fā)展，植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域里不斷研究出新的轉(zhuǎn)基因植物檢測技術(shù)，檢測范圍發(fā)展到DNA水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平3個方向。檢測方法主要有PCR檢測方法、Souther雜交、Tail-PCR、基因芯片、RT-PCR檢測、實(shí)時熒光定量PCR檢測、Nouther雜交、ELISA方法、試紙條檢測法等。

2.1 蛋白質(zhì)水平檢測

2.1.1 ELISA檢測法 通過歐洲多個實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果可以確定，運(yùn)用ELISA方法檢測Bt蛋白含量結(jié)果可信度幾乎達(dá)到100%，目前普遍應(yīng)用ELISA檢測法檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻Bt蛋白含量。2018年黑龍江大學(xué)李榮田等使用ELISA方法檢測出不同Bt基因在植物細(xì)胞蛋白質(zhì)層面的表達(dá)量（或最高表達(dá)量）是有差別的[10]。ELISA檢測法是通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否發(fā)生顏色反應(yīng)及生成物質(zhì)顏色變化的深淺來判定檢測信號的存在和含量的。抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)的目標(biāo)蛋白（抗原）和抗體存在特異性反應(yīng)，結(jié)合了酶和底物之間高效催化作用，也就是說加入酶催化底物后，底物就會發(fā)生反應(yīng)并且生成有顏色的物質(zhì)，酶含量和生成物質(zhì)顏色深淺呈正比，間接顯示了目標(biāo)蛋白含量的多少。因此，ELISA檢測法即可以定性檢測抗蟲基因是否存在，也可以定量分析抗蟲基因表達(dá)量[11]。該方法現(xiàn)在已經(jīng)推廣試劑盒的應(yīng)用，可快速實(shí)驗(yàn)并且準(zhǔn)確度高。

2.1.2 試紙條法 試紙條法是將含有特異抗體的蛋白提取液交聯(lián)到試紙條和有顏色物質(zhì)上，當(dāng)紙上抗體和蛋白提取液中特異抗原結(jié)合之后，再與特異的帶有顏色的抗體進(jìn)行反應(yīng)，于是就在試紙條上出現(xiàn)了三明治狀的色帶。假如沒有抗原，就沒有三明治色帶。中國科學(xué)院王彤彤[12]采用快速檢測試紙條，僅僅需要5min就可以準(zhǔn)確測定出抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻中Bt蛋白含量。由此可見，試紙條法可以在現(xiàn)場進(jìn)行檢驗(yàn)或初篩時，不需特殊的儀器設(shè)備就可以完成實(shí)驗(yàn)，將來有著較好的應(yīng)用前景。

2.2 RNA水平檢測

2.2.1 半定量RT-PCR檢測 這是一種通過檢測特異性mRNA的靈敏度來分析基因表達(dá)的快速方法。此方法首先提取抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻總RNA，然后以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA;再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)產(chǎn)物，最后通過限制性內(nèi)切酶酶解或者核苷酸測序來進(jìn)一步鑒定PCR產(chǎn)物[13]。半定量RT-PCR技術(shù)雖然快速簡便，但是它是一種粗略的估計基因表達(dá)量的方法，若要精確計算基因表達(dá)量，還需要定量PCR技術(shù)。

2.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)PCR中不能定量檢測的局限性，其原理是在普通PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以對未知模板進(jìn)行定量分析[14]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘇長青博士建立了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻科豐8號實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，并用此方法確定了科豐8號品系外源抗蟲基因?yàn)?0拷貝[15]。因此，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是外源基因定性定量分析先進(jìn)技術(shù)，其優(yōu)勢在于準(zhǔn)確性高、假陽性低、特異性好、靈敏度高。因?yàn)閼?yīng)用熒光信號檢測對樣品初始模板濃度進(jìn)行定量，能夠使結(jié)果誤差小;過程中操作簡單、自動化程度高;整個反應(yīng)在閉管條件下一步反應(yīng)完成，既不會交叉污染，更保護(hù)了實(shí)驗(yàn)環(huán)境[16]。

2.2.3 Northern雜交 Northern雜交是一種通過檢測RNA的表達(dá)水平來檢測外源抗蟲基 因表達(dá)的方法。假如整合到水稻染色體上的外源抗蟲基因能正常表達(dá)，那么轉(zhuǎn)化水稻植株細(xì)胞內(nèi)有其特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物生成。首先，將提取的植物總RNA用變性凝膠電泳分離;然后，將凝膠上不同排布的RNA分子按照原位轉(zhuǎn)移到固定膜上，在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，特異性標(biāo)記的探針會與膜上的同源序列進(jìn)行雜交;最后，通過探針的標(biāo)記性質(zhì)就可以檢測出雜交體，而且轉(zhuǎn)錄的特異性RNA分子量的大小可以直接通過雜交體在膜上的位置來判斷。若無雜交，樣品無雜交帶出現(xiàn)，表明外源基因已經(jīng)整合到水稻細(xì)胞染色體上，只是外源抗蟲基因在某些部位和特定生理狀態(tài)下并未有效表達(dá)，不能說明外源基因不表達(dá)，需要接下來的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步判斷[17]。

2.3 DNA水平檢測

2.3.1 簡單PCR技術(shù) 簡單PCR技術(shù)是抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻外源基因檢測最成熟、基礎(chǔ)的一項(xiàng)檢測。黃曉西[18]運(yùn)用簡單PCR技術(shù)檢測了轉(zhuǎn)新型Bt基因抗蟲水稻146株，轉(zhuǎn)化率達(dá)32.8%。其原理是體外利用極少量DNA模板酶促合成特異DNA片段，設(shè)計特異性引物，添加催化DNA聚合酶，經(jīng)過高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，達(dá)到目的基因片段快速擴(kuò)增的過程。簡單PCR技術(shù)只能滿足一種或少數(shù)幾個轉(zhuǎn)基因品種的檢測需要，并且檢測結(jié)果一旦出現(xiàn)假陽性的缺陷，就會導(dǎo)致工作程序重復(fù)驗(yàn)證，耗費(fèi)大量時間，現(xiàn)在除簡單的定性鑒定之外，已不能滿足當(dāng)前工作中快速通關(guān)的要求。

2.3.2 多重PCR技術(shù) 多重PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展出能夠同時擴(kuò)增多個核算片段的一種新型PCR技術(shù)。在應(yīng)用時要求使用至少兩對熔解溫度相近、彼此不發(fā)生相互作用的2隊(duì)引物，并且擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小即相近又能通過電泳分離。反映到植物基因工程應(yīng)用，水稻中的內(nèi)參基因、外源基因、355啟動子、NOS終止子可以在同一個PCR體系中同時用多套引物分別擴(kuò)增出來。敖金霞[19]建立了適用轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和水稻深加工產(chǎn)品定性檢測的5重巢式PCR檢測方法，其檢測靈敏度為0.005%。此方法簡化了操作程序，既節(jié)省了模板DNA，又減少費(fèi)用，是一種非常有發(fā)展前景的定性PCR檢測方法[20]。

2.3.3 Southern Blot雜交 Southern Blot通常被用來鑒定外源基因在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻中的整合情況，即檢測抗蟲基因整合在水稻基因組中的拷貝數(shù)情況。其基本原理是首先用限制性內(nèi)切酶將水稻基因組酶切消化，標(biāo)記目的基因片段為探針備用，然后將消化的基因組DNA與標(biāo)記好探針在雜交膜上進(jìn)行雜交，包含目的基因的基因組片段與探針會因?yàn)榘l(fā)生同源重組而顯示雜交信號，目標(biāo)基因拷貝數(shù)就自然得出。因此，金永梅[21]等利用Southern Blot技術(shù)檢測出單拷貝抗蟲水稻植株，以此為前提，確定出外源抗蟲基因的插入位點(diǎn)。該技術(shù)雖然操作程序復(fù)雜，周期長和成本高，但是因其高度準(zhǔn)備性，因此一直以來都被認(rèn)為是篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株最為可靠、穩(wěn)定的方法[22-24]。

2.3.4 Tail-PCR Tail-PCR是可以確定外源抗蟲基因它插入水稻基因組位置的技術(shù)。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院金詠梅馬瑞等利用Tail-PCR方法，將轉(zhuǎn)cry1C基因抗蟲水稻吉生粳3號的左、右邊界旁側(cè)序列，依據(jù)旁側(cè)序列確定T-DNA在基因組中的插入位點(diǎn)，并建立吉生粳3號品系特異性 PCR方法。利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入的外源抗蟲基因在宿主水稻基因組的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，每個轉(zhuǎn)化事件中外源抗蟲基因和水稻基因組DNA拼接組成的旁側(cè)序列具有唯一性。T-DNA整合過程是一個復(fù)雜的異常重組過程，包括水稻基因組整合位點(diǎn)的刪除和重復(fù)，T-DNA序列的刪除和重復(fù)，以及水稻染色體上的易位和到位等現(xiàn)象。染色體步移（Chromosomewalking）是指從生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發(fā)，逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關(guān)系的目標(biāo)序列的方法。分離旁側(cè)序列的染色體步移方法主要采用染色體步移技術(shù)中的半隨機(jī)引物PCR策略。半隨機(jī)引物PCR策略中的熱不對稱交錯PCR（Tail-PCR）是將目標(biāo)序列旁的已知序列中設(shè)計的3個嵌套的特定引物（specialprimerSP1，SP2，SP3）分別與1個具有低Tm值的隨機(jī)簡并引物相結(jié)合，根據(jù)引物的長短和特異性的差異設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異產(chǎn)物的方法。根據(jù)所分離的旁側(cè)序列，通過與NCBI 的比對分析確定T-DNA在基因組中的整合位點(diǎn)。該序列是不同轉(zhuǎn)基因作物品系的特異性身份標(biāo)識，根據(jù)其建立的品系特異性檢測方法能快速、準(zhǔn)確地鑒定不同的轉(zhuǎn)基因作物品系[25-26]。利用Tail-PCR技術(shù)檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，保證了抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻檢測的準(zhǔn)確性和專一性，為監(jiān)管抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的育種、生產(chǎn)、加工和銷售提供了可靠的技術(shù)支撐[27-28]。利用外源抗蟲基因在水稻基因組上整合位點(diǎn)的唯一性，可以建立抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系特異性檢測方法，該方法可以根據(jù)外源抗蟲基因與旁側(cè)水稻基因組連接區(qū)序列為靶標(biāo)設(shè)計引物，使用Tail-PCR方法擴(kuò)增出對照和抗蟲轉(zhuǎn)基因品系特異的PCR條帶[29]。目前，我國抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻安全試驗(yàn)階段過程中，要求提供轉(zhuǎn)入外源抗蟲基因提供插入位點(diǎn)堿基序列。因此，Tail-PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商品化不可或缺的一項(xiàng)技術(shù)。

2.3.5 基因芯片 當(dāng)常規(guī)的一些檢測方法需要操作繁瑣的轉(zhuǎn)膜、雜交等，費(fèi)用高同時不能快速精準(zhǔn)的檢測，有些方法更不適合大批量樣品的檢測。最近幾年發(fā)展起來一種專門用來檢測核酸的生物芯片，亦稱基因芯片，是多學(xué)科交叉融合產(chǎn)生的高新技術(shù)產(chǎn)品?；蛐酒抢煤怂峄パa(bǔ)雜交原理研制的，其原理是在一塊固相支持介質(zhì)表面固定已知序列的DNA/RNA片斷，形成DNA/RNA微矩陣，即核算探針;將熒光標(biāo)記分子通過體外轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增等技術(shù)摻入到樣品RNA或DNA當(dāng)中，與位于微陣列上的已知DNA核酸探針序列雜交，通過熒光顯影法等對雜交信號強(qiáng)度進(jìn)行檢測分析，獲得序列完全互補(bǔ)的探針序列，再用計算機(jī)軟件比較和綜合分析數(shù)據(jù)后，即可獲得樣品中分子數(shù)量和大量基因表達(dá)信息[30]。目前，將通用的報告基因、抗蟲基因、啟動子和終止子的特異片斷制成檢測芯片與待測產(chǎn)品的DNA進(jìn)行雜交，雜交信號由掃描儀掃描后再經(jīng)計算機(jī)軟件進(jìn)行分析，就可以判斷待測樣品是否為抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻。

3 小結(jié)與展望

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻檢測涉及到的檢測內(nèi)容主要是蛋白質(zhì)檢測和核酸檢測。蛋白質(zhì)檢測主要利用抗原抗體特異性反應(yīng)原理進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在核算檢測方面，PCR技術(shù)經(jīng)過不斷優(yōu)化后，定性、定量檢測檢測范圍更廣，具有特異性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。近年來發(fā)展的Tail-PCR技術(shù)，雖然建立在Southern Blot技術(shù)基礎(chǔ)之上，可是能夠定位抗蟲基因的位置，這在技術(shù)領(lǐng)域上是一大突破?；蛐酒夹g(shù)雖然成本高，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，但是其優(yōu)勢在于高密度、高通量，用量少，快速而且準(zhǔn)確。因此，今后轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究的發(fā)展趨勢必然是將各種檢測技術(shù)結(jié)合起來，建立更加高效、快速、便捷、高通量、低成本的新檢測方法。

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（責(zé)編：張宏民）