袁琴琴,劉文營

(1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,山東菏澤 274000; 2.中國肉類食品綜合研究中心,北京 100068)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引發(fā)的一種具有廣泛傳播途徑的高致病性傳染病[1-2]。自首次在非洲發(fā)現(xiàn)以來[3],在美洲、歐洲、亞洲和大洋洲均發(fā)生了ASF疫情,如近年來在保加利亞[4]、波蘭[5-6]、烏克蘭[4]、拉托維亞[7]、匈牙利[8]和中國[4]等國家爆發(fā)的ASF事件,且呈現(xiàn)出愈演愈烈的趨勢。盡管ASFV最早見諸于報端是在1921年[3],但是由于其基因型種類較多、基因組較大,以及易于產(chǎn)生變異,導(dǎo)致各地發(fā)現(xiàn)的ASFV遺傳信息均不一致,如在尼日利亞爆發(fā)病的毒衣殼蛋白(VP72)基因與在烏干達、多米尼加共和國和西班牙爆發(fā)的病毒只有92.2%、92.4%和97.2%的同源性[9],均發(fā)生了較大程度的變異,為疫情的控制帶來巨大壓力。因此,該文就非洲豬瘟病毒、傳播途徑、疫苗研究進展和在我國的傳播過程進行了概括總結(jié),以期就非洲豬瘟疫情的控制和非洲豬瘟病毒的消除提出可行的綜合控制策略,為我國肉制品生產(chǎn)和消費安全提供借鑒。

1 非洲豬瘟病毒及其傳播

1.1 非洲豬瘟病毒

非洲豬瘟病毒最早由Montgomery發(fā)現(xiàn)于因疾病死亡的豬只,最開始被錯認(rèn)為是霍亂的變體,并將之命名為East African swine fever virus,認(rèn)為該病毒自然界中的載體是疣豬和南非野豬。ASFV在很長一段時間內(nèi)一直被人忽略,直到1957年在非洲大陸以外的葡萄牙爆發(fā),以及1960年的再次爆發(fā)并造成了巨大損失,之后ASFV傳播到了西班牙等伊比利亞半島[10]。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬(AsJivirus),其直徑大小為172～200 nm,衣殼呈現(xiàn)為二十面體對稱,基因組為一條170～190 kbp的雙鏈DNA分子[11-12],約含151個開放閱讀框(ORFs)。ASFV表面糖蛋白多肽的存在使得ASFV具有吸附在紅細(xì)胞上的特性,但這種特性會被抗血清所阻斷[13]。豬感染ASFV后的臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)燒(40～42 ℃),伴隨有呼吸困難、心跳加快、分泌物增多,以及胃腸粘膜和淋巴結(jié)明顯出血等癥狀,死亡率高達100%[14]。

1.2 非洲豬瘟病毒的傳播

非洲豬瘟病毒的傳播有多種形式,其中較為關(guān)鍵的是鈍緣蜱類生物傳播途徑,鈍緣蜱類為非洲豬瘟病毒的傳播提供良好的載體,并為非洲豬瘟病毒的保存,甚至是變異提供了良好的基礎(chǔ)[15]。同時,除豬被攜帶病毒的蜱等媒介昆蟲叮咬感染非洲豬瘟外,健康豬與患病豬或污染物直接接觸是非洲豬瘟最主要的傳播途徑[16],具有生物活性的ASFV也會通過生豬及其制品的貿(mào)易和走私、國際旅客的食物攜帶、國際運輸工具和疫區(qū)相關(guān)制品的餐廚剩余物,以及野豬的遷徙實現(xiàn)傳播[17-19]。

ASFV遺傳信息的復(fù)雜性和多變性,以及傳播途徑的多樣性,使得ASF的爆發(fā)具有不確定性,也為ASF的鑒定、疫苗開發(fā)和防控帶來很大的難度。

2 非洲豬瘟病毒的鑒定及疫苗開發(fā)

2.1 非洲豬瘟病毒的鑒定技術(shù)研究

ASFV復(fù)雜多變,給ASF的預(yù)防和控制帶來了很大的難題,尤其是近年來在歐洲、非洲和亞洲等地的頻繁爆發(fā),成為僅次于瘋牛病的世界性問題。基于此,迫切需要開展快速且靈敏的鑒定技術(shù)。

2.1.1 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的檢測研究 PCR技術(shù)是用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),是生物體外的特殊DNA復(fù)制,其最大特點是能將微量的DNA大幅增加[20],即PCR技術(shù)具有高度靈敏性[21]。冷依伊等[22]采用多重RT-PCR檢測方法,在對ASFV、水皰性口炎病毒(VSV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)的同時檢測研究時,其參照Gen bank中登記的病毒株序列,通過選擇病毒的保守序列設(shè)計特異性引物,建立快速的檢測方法,能夠快速且準(zhǔn)確的實現(xiàn)對五種病毒的同時檢測。單虎等[23]也參照Gen bank中登記的23株ASFV P72蛋白全基因序列,通過特異性引物的設(shè)計,以及最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的構(gòu)建,實現(xiàn)了對ASFV的敏感、快速檢測。張泉等[24]亦是根據(jù)ASFVP72基因的核苷酸序列,通過引物以及熒光標(biāo)記的TaqMan探針的設(shè)計,以含P72基因的重組質(zhì)粒作為陽性模板,建立的常規(guī)PCR和Real-time PCR方法的檢測方法,均能快速識別,且Real-time PCR的檢測靈敏度是20個拷貝的病毒核酸分子?；赑CR技術(shù),研究者也開發(fā)了納米PCR技術(shù),最低核酸拷貝數(shù)檢出量可以達到10個拷貝[25]。

2.1.2 基于酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)的檢測研究 ELISA方法為在對大分子抗原和特異性抗體檢測時,將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù),其作用對象主要是I、Ⅱ、III和IV型膠原蛋白和纖維粘連蛋白[26]。由ELISA檢測結(jié)果顯示,P72蛋白對ASFV血清具有生物活性,以此作為間接法的包被抗原,可以進行非洲豬瘟病毒的檢測,且具有快速、簡單和無污染的特性[27]。而以原核表達的非洲豬瘟病毒pK205R蛋白為包被抗原的間接ELISA抗體檢測方法,僅對ASFV血清檢測為陽性,與豬瘟病毒、豬大腸桿菌和副豬嗜血桿菌陽性血清等均無交叉反應(yīng),具有良好的特異性,能夠?qū)崿F(xiàn)ASFV間接ELISA方法的快速檢測[28]。同樣,靳雯雯[29-30]以VP73純化蛋白作為包被抗原,ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性/陰性血清樣品為檢測樣品,HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗,建立了ASFV間接ELISA抗體檢測方法,對ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的檢測靈敏度可以達到1∶2560,且具有較高的可重復(fù)性。

2.1.3 基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification technique,RPA)的檢測研究 RPA是被稱為可以替代PCR的核酸檢測技術(shù),其利用重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-DNA復(fù)合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。同源序列被引物定位之后就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成,對模板上的目標(biāo)區(qū)域進行指數(shù)式擴增[31]。鄔旭龍等[32]利用RPA,通過開展ASFVB646L(P72)基因引物和探針的設(shè)計,建立了針對ASFV的實時熒光RPA方法,實現(xiàn)了ASFV的快速定性鑒定。同樣,王建昌等[33]也建立了一種ASFV的RPA等溫檢測方法,該方法于38 ℃恒溫反應(yīng)30 min,即可實現(xiàn)對目的片段的有效擴增。其以包含P72基因的ORF質(zhì)粒為模板,RPA的檢測限達到2～10個拷貝,與國際通用的實時熒光PCR方法檢測限一致,但檢測限高10倍,且RPA僅特異性擴增P72基因,對其它病毒沒有顯示活性。

2.2 非洲豬瘟疫苗的制備研究

非洲豬瘟病毒擁有超過28種分子量介于11.5～243 kDa的肽段,組成病毒核的至少有14種蛋白質(zhì),VP 73主要分布于病毒的衣殼蛋白,VP 42是肌動蛋白,VP 172、VP 162、VP 146和VP 73均可以作為抗原[34]。鑒于非洲豬瘟病毒遺傳信息較大、基因型較多和抗感染機制復(fù)雜,使得科學(xué)家不得不從多角度開展疫苗的研制工作,包括滅活疫苗、弱毒疫苗[35]、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗[36]和核酸疫苗等[15,37]。研究者做了大量的工作,進行了很多嘗試,但是由于非洲豬瘟病毒基因型的多樣性[38],且遺傳信息數(shù)量巨大,具有復(fù)雜多樣的免疫逃逸機制,不僅可以不受宿主免疫細(xì)胞的作用,而且即使疫苗產(chǎn)生一定水平的抗體,仍不具備殺死或者抑制豬瘟病毒的能力[39]。所以在采取綜合防控技術(shù)開展非洲豬瘟疫情的防治時,還要加強疫苗研制新技術(shù)的攻克和利用。

3 非洲豬瘟的發(fā)生對我國豬肉制品產(chǎn)業(yè)的影響

我國是世界上最大的豬肉生產(chǎn)和消費國,豬肉產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的一半左右[40],占我國肉制品總量的63.3%[41],豬肉的生產(chǎn)安全直接影響到畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和我國居民的生活質(zhì)量。ASF疫情的發(fā)生,不僅嚴(yán)重消蝕了消費者的消費耐心,極大限制了我國安徽等生豬養(yǎng)殖大省的生豬輸出,嚴(yán)重干擾了生豬產(chǎn)業(yè)秩序。

3.1 非洲豬瘟對我國肉制品生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的影響

ASF是我國重點防范的外來傳染性疾病[42],我國農(nóng)業(yè)部門也做了大量的防范預(yù)案[43],但是鑒于ASFV的復(fù)雜性,如表1所示,自2018年8月1日在遼寧省沈陽市發(fā)現(xiàn)首例非洲豬瘟疫情以來,已經(jīng)在在20余個省、自治區(qū)和直轄市檢出非洲豬瘟病毒陽性,ASF已經(jīng)成為全國性的問題,而疫情解除所需的時間平均為6周左右。ASF疫情的爆發(fā)不僅影響了我國豬肉生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展,還嚴(yán)重限制了本地生豬的輸出,在造成大量經(jīng)濟損失的同時,也嚴(yán)重破壞了本地區(qū)的養(yǎng)殖生態(tài),對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重沖擊[44]。

表1 我國發(fā)生非洲豬瘟疫情和解除封鎖時間Table 1 The outbreak and the blockade time of African swine fever in China

續(xù)表

對疫區(qū)生豬限制移動,嚴(yán)禁運輸、加工、經(jīng)營病死豬及其產(chǎn)品,是我國進行畜禽傳染性疾病控制的常用手段[45],非洲豬瘟疫情的爆發(fā),使得疫區(qū)出現(xiàn)了生豬無法調(diào)出、存欄生豬出售速度加快和豬價持續(xù)走低的現(xiàn)象;其次疫區(qū)養(yǎng)殖戶生豬養(yǎng)殖效益下降,養(yǎng)殖戶養(yǎng)豬積極性下降;最后將導(dǎo)致豬肉及其制品消費量下滑,生豬存欄量走低[46]。通過限制生豬的運輸轉(zhuǎn)移為疫情的控制提供了有力幫助,但是這也造成了像東北地區(qū)和河南等生豬輸出大省生產(chǎn)秩序的混亂,北京等豬肉消費重點區(qū)域屠宰企業(yè)面臨無豬可宰、生產(chǎn)陷入停滯的困境[47-48]。

肉制品原料直接影響著產(chǎn)品的安全性和營養(yǎng)價值,是肉制品品質(zhì)的決定性影響因素。非洲豬瘟病毒的檢出不僅給本地居民的消費和生產(chǎn)安全帶來嚴(yán)重困擾,而且嚴(yán)重影響了肉及肉制產(chǎn)品的流通,對國民經(jīng)濟,尤其是出口型經(jīng)濟帶來巨大的負(fù)面影響[49]。

3.2 非洲豬瘟對我國本土豬種資源保護的影響

ASF疫情的爆發(fā),不僅對我國養(yǎng)殖的主要豬種產(chǎn)生了巨大影響,同時也對我國本土豬種的保護和利用帶來挑戰(zhàn)。如桃源黑豬作為我國本土優(yōu)良黑豬豬種[50],是地理標(biāo)志產(chǎn)品[51],多數(shù)分布在湖南省桃源縣轄域[52],桃源黑豬又是我國獨有的重要母本基因來源[53],以此為基礎(chǔ)繁育的優(yōu)良品種有湘村黑豬等[50]。2018年10月22日和27日在湖南省桃源縣檢出ASFV陽性,鑒于非洲豬瘟病毒的強致死性,給桃源黑豬等地方品種資源的保護帶來了巨大壓力。

4 非洲豬瘟的應(yīng)對策略

針對非洲豬瘟疫情的防控,國內(nèi)外開展了廣泛的研究和實踐,如加強野生動物研究,加強疫苗開發(fā)和相關(guān)技術(shù)的儲備等[54-55]。盡管在疫情爆發(fā)之前,我國有大量借鑒和實施了疫情防控預(yù)案[56],但是鑒于我國養(yǎng)殖企業(yè)數(shù)量多且分散、地域廣闊、物流體量巨大等基本國情,使得我國在對ASF疫情的防控和消除上有巨大難度。

基于國際上普遍使用的防控措施,ASF防控首要任務(wù)依然是完善綜合防控措施,同時加快新型疫苗技術(shù)的研制攻關(guān)。結(jié)合我國的生產(chǎn)實際,可采取的綜合防控措施如下:

4.1 加強原位檢驗檢疫管理、禁止疫區(qū)生豬的跨地區(qū)轉(zhuǎn)移

鑒于非洲豬瘟病毒擁有5～15 d較長時間的潛伏期,早期癥狀不明顯會給管理人員很多假象,需要加強特殊時期的生豬運輸管理,不僅要嚴(yán)控染病和攜帶病原體生豬的運輸,還要嚴(yán)格執(zhí)行運輸車輛等工具的消毒管理制度。加強攜帶病原體生豬的原地處理能力,加強生豬及其副產(chǎn)物無害化處理軟硬件體系建設(shè),包括相關(guān)操作人員的安全操作培訓(xùn)、無害化處理設(shè)備的運營管理和無害化處理協(xié)調(diào)機制建設(shè)等。

4.2 加強非洲豬瘟病毒的境外傳入防御

傳染性病毒的傳播不僅影響到人民群眾的身體健康[57],還會對國內(nèi)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)帶來毀滅性影響,需要加強境外輸入物品的監(jiān)督和檢查。自1921年爆發(fā)ASF疫情以來,一直有不間斷的疫情報道,尤其是近期在歐洲等地區(qū),呈現(xiàn)出不可控的局面。歐洲是豬肉的主要輸出地區(qū)之一,也是生豬屠宰裝備的主要出口地區(qū)之一,而我國是世界上最大的豬肉進口國。目前我國主要豬種是引進的雜交三元豬,與國外豬種親緣相近,更容易受感染,這就需要加強控制ASFV的輸入管理,不僅是對豬肉及其制品、操作工具,疫區(qū)的其它物品也需要被執(zhí)行特殊時期的安全操作程序,來保證本地生豬生產(chǎn)的安全性。

4.3 加強禁止餐廚剩余物進入生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的監(jiān)管

我國餐廚剩余物體產(chǎn)量巨大,餐廚剩余物體含有大量的蛋白質(zhì)等有機質(zhì),當(dāng)作為補充飼料進行畜禽養(yǎng)殖時,不僅具有較好的日增重、料肉比和屠宰率,而且不會對肉的品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[58]。鑒于ASF疫情的發(fā)作有5～15 d的潛伏期,以及肉制品可能存在加工不充分的情況,若生豬食用了攜帶有ASFV的餐廚剩余物,就會發(fā)生ASFV的傳播,導(dǎo)致二次事故的發(fā)生。

基于此,需要嚴(yán)控餐廚余物進入生豬飼養(yǎng)環(huán)節(jié),一是要加強餐廚剩余物的源頭控制,提升餐廚剩余物的資源化利用效率,加強餐廚剩余物的集中處理水平;二是要加強餐廚剩余物的轉(zhuǎn)運管理,在運輸環(huán)節(jié)控制餐廚剩余物轉(zhuǎn)向生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié);三是要加強養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的監(jiān)控管理,通過加強養(yǎng)殖企業(yè)和個人的安全生產(chǎn)意識,杜絕餐廚剩余物的濫用;四是要引導(dǎo)和鼓勵消費者減少食物浪費,鼓勵餐飲企業(yè)設(shè)法降低餐廚剩余物的生成量。

4.4 增加屠宰副產(chǎn)物的利用途徑,嚴(yán)控污染物的排放

豬血等屠宰副產(chǎn)物是疾病傳播的重要媒介,為實現(xiàn)非洲豬瘟疫情的控制,除對生豬的檢驗和運輸嚴(yán)格控制外,還需要對豬血、廢水、固體廢棄物等處理進行嚴(yán)格監(jiān)督和控制。不僅要嚴(yán)控豬血及其制品用作生豬飼料,還要加強非常時期豬血的應(yīng)用管理,如對疫區(qū)生豬屠宰的豬血進行集中收集和處理;同時需要強化血液、皮毛等生豬屠宰副產(chǎn)物的無害化深加工應(yīng)用水平,如利用豬血的高蛋白質(zhì)含量特性,開發(fā)氨基酸肽肥,開發(fā)能夠消除病原菌污染的加工工藝,降低和避免非洲豬瘟病毒的傳染。對于生豬屠宰過程中的廢水等排放,應(yīng)嚴(yán)格按照遵從《肉類加工工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》等相關(guān)法規(guī)的要求,開展屠宰污水的無害化處理監(jiān)管。

4.5 加強豬肉制品的追溯機制建設(shè)

充分利用大數(shù)據(jù)、物聯(lián)網(wǎng)等技術(shù),加強豬肉制品的追溯機制建設(shè),對突發(fā)個體事件的影響因素進行整體分析,實施有針對性的應(yīng)急方案,可以降低疫情爆發(fā)時的控制成本[59]。如開展飼料原料生產(chǎn)過程、加工、運輸,生豬輸出途徑、屠宰廠家、肉制品加工方式、肉制品銷售途徑等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計,能夠進行不同事件的相關(guān)性分析,縮減消除疫情所需要的時間和人力物力成本。

4.6 加強農(nóng)業(yè)保險制度建設(shè),為受沖擊嚴(yán)重企業(yè)提供經(jīng)濟援助

ASF是一種嚴(yán)重的高致死傳染病,一旦發(fā)生就會對當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖、屠宰、肉制品加工和貿(mào)易企業(yè)帶來毀滅性打擊,我國自非洲豬瘟疫情爆發(fā)以來,已經(jīng)撲殺了60余萬頭的生豬,給養(yǎng)殖企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。政府和行業(yè)在加強農(nóng)業(yè)保險制度實施的同時,應(yīng)采取多種方式為受損的企業(yè)提供經(jīng)濟援助,幫助其消除隱患恢復(fù)生產(chǎn),進而保障食品安全,這也是國際上通用的挽救策略[60]。

綜上,通過控制傳染性病毒的傳播源頭、切斷傳播途徑、突發(fā)疫情的有效控制、傳染性載體的無害化消解等,可以有效控制AFS疫情的發(fā)生和傳播;以及運用大數(shù)據(jù)技術(shù),可以實現(xiàn)突發(fā)事件的關(guān)聯(lián)性分析和精準(zhǔn)識別;通過開展資金補助和技術(shù)支持等,能夠極大促進生豬養(yǎng)殖業(yè)的恢復(fù)發(fā)展,為消費者的飲食安全和平衡物價提供有效支撐。