李美倫 - 姜萌藝 - 龔川杰 - 何 利

(四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014)

米發(fā)糕的傳統(tǒng)生產方式是在新鮮米漿中接入老漿進行發(fā)酵[1-2]，發(fā)酵過程中微生物體系的菌種比例和活性難以控制，會導致其生產周期延長且產品質量不穩(wěn)定[3][4]9。

在淀粉食物原料的發(fā)酵過程中，優(yōu)勢菌主要為酵母菌和乳酸菌，兩者可進行協(xié)同發(fā)酵并對產品的風味和營養(yǎng)成分的形成起著重要作用[1,3,5-6]。目前，對米發(fā)糕發(fā)酵劑的研究多為雙菌發(fā)酵劑[7-8][9]32-42，該種發(fā)酵劑與老漿發(fā)酵相比仍有一定差距，因而米發(fā)糕發(fā)酵劑的菌種組成還有待進一步優(yōu)化。發(fā)酵制品中的微生物組成與地理位置有很大聯(lián)系[10]，目前尚未見有關中國四川地區(qū)米發(fā)糕的研究報道。本試驗擬以四川雅安地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵米漿為研究對象，對其中具有良好發(fā)酵性能的乳酸菌和酵母菌進行篩選，并用作米發(fā)糕的復合發(fā)酵劑，以期為米發(fā)糕的標準化、規(guī)?；a提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵米漿：采自四川省雅安市雨城區(qū)消費者評價較好的米發(fā)糕作坊，共5份；

早秈米、白砂糖：均購于四川省雅安市吉選超市；

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH (6.2±0.2)，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，碳酸鈣15 g，121 ℃滅菌20 min；

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸出粉130 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH (6.0±0.2)，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，121 ℃滅菌20 min[11]；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麥芽浸粉：生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；

PCR反應試劑、DNA Marker：生工生物工程 (上海) 股份有限公司；

其他試劑：分析純，雅安市萬科化學試劑公司。

1.1.2 主要儀器設備

PCR儀：C1000型，美國Bio-Rad公司；

冷凍離心機：D-37520型，美國Thermo公司；

物性分析儀：TA-XT plus型，英國Stable Micro systems公司；

氣相色譜—質譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

(1) 分離：取米漿樣品進行梯度稀釋并分別涂布于MRS培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基于37 ℃(麥芽汁培養(yǎng)基于28 ℃)培養(yǎng)48 h。分別挑取具有溶鈣圈及不同菌落特征的疑似乳酸菌菌落和具有不同菌落特征的疑似酵母菌菌落進行劃線純化。

(2) 篩選：對疑似乳酸菌進行革蘭氏染色和菌株形態(tài)觀察，選擇具有典型乳酸菌特征的菌株進行斜面保藏和甘油管冷凍保藏(菌液和60%甘油按1∶1的體積比接入甘油管內并置于實驗室-80 ℃冰箱內)。對疑似酵母菌進行水浸片鏡檢，選擇具有典型酵母菌特征和良好產氣性能的菌株進行斜面保藏和甘油管冷凍保藏(與乳酸菌菌種保藏方法一致)。

1.2.2 分子生物學鑒定 將篩得的乳酸菌劃線至MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，酵母菌劃線至麥芽汁培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng)24～48 h。乳酸菌16S rDNA鑒定選用細菌通用引物27F和1492R[12]，酵母菌26S rDNA鑒定選用真菌通用引物NL1和NL4[13]，均以挑取單菌落至7 μL無菌水中得到的菌液為模板進行擴增。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司進行測序。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，選擇相似度較高的序列，采用MEGA 5.0軟件構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長性能測定 將活化后的乳酸菌菌液按2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基(酵母菌菌液按同樣接種量接入麥芽汁培養(yǎng)基)，在0～24 h時，每隔2 h測定菌液在600 nm處的OD值，以空白培養(yǎng)基為對照。

1.2.4 液體復合發(fā)酵劑的制備 將培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的菌液(乳酸菌濃度為108CFU/mL，酵母菌濃度為107～108CFU/mL)，離心(4 000 r/min，30 min)，用0.9%的生理鹽水使菌體復懸，備用[9]22-23。經預試驗確定出植物乳桿菌分別與釀酒酵母菌、矮小假絲酵母菌的復配體積比為1∶9時，發(fā)酵得到的米發(fā)糕具有良好的感官和質構特性。因此在已經確定植物乳桿菌與酵母菌比例的基礎上，確定植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母菌懸液體積比為1.0∶1.8∶7.2，1.0∶3.0∶6.0，1.0∶4.5∶4.5，1.0∶6.0∶3.0，1.0∶7.2∶1.8(依次對應1～5號)的比例進行復配，制備液體復合發(fā)酵劑。

1.2.5 米發(fā)糕的制作 根據(jù)文獻[4]36修改如下：早秈米在30 ℃下浸泡21 h，瀝水后磨成米粉并過60目篩，將所得米粉與水按8∶2的質量比混勻得到米漿。以米漿量為基準，接入體積分數(shù)為5%的復合發(fā)酵劑和6 g/100 mL的白砂糖后攪勻，于35 ℃發(fā)酵12 h，發(fā)酵結束后，再加入14 g/100 mL 的白砂糖進行調味，得到發(fā)酵米漿。將米漿定量盛入模具內，沸水蒸20 min，得到米發(fā)糕。

1.2.6 感官評定 感官評定小組由10人組成。感官評價標準參考文獻[4]21制訂，見表1。

1.2.7 質構特性測定 采用P/36 R探頭對樣品進行TPA測定，參數(shù)設置參考文獻[14]。

1.2.8 米發(fā)糕風味物質的測定 色譜條件根據(jù)文獻[9]43-44進行設定，定量定性分析：將GC-MS圖譜用NIST.11譜庫進行檢索，僅報告匹配度>80%的鑒定結果并采用面積歸一化法計算樣品中各組分的相對含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010繪制圖表，用 SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，顯著性分析采用Duncan檢驗，P<0.05判定為顯著性變化。

2 結果與分析

2.1 鑒定結果

2.1.1 菌落及菌株形態(tài)特征 對米漿樣品中的疑似乳酸菌進行分離純化獲得12株具有溶鈣圈的純菌株，其中2株為革蘭氏陽性菌且具有典型的乳酸菌菌落及菌株形態(tài)特征，將其分別編號為R-1a、R-2b。對米漿樣品中的疑似酵母菌進行分離純化獲得7株純菌株，其中5株具有酵母菌典型的菌落、菌株形態(tài)特征且在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)其均具有良好的產氣性能，將其分別編號為J-1a、J-2a、J-3a、J-4a、J-5a。菌落及菌株形態(tài)特征見表2。

表1 感官評價表

2.1.2 分子生物學鑒定 經Blast相似性檢測發(fā)現(xiàn)，R-1a和R-2b與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性均為99%，故將其鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，但R-1a和R-2b的基因序列有所不同；J-1a、J-4a和J-5a與矮小假絲酵母菌(Candidahumili)的同源性均為99%且基因序列相同，故將其鑒定為矮小假絲酵母菌(Candidahumili)；J-2a和J-3a與釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的同源性均達100%且基因序列相同，故將其鑒定為釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。根據(jù)菌落、菌株形態(tài)特征及鑒定結果，選擇R-1a、R-2b和J-1a、J-2a進行后續(xù)試驗。

2.2 菌株生長特性

菌株24 h內的生長曲線見圖2。R-1a和R-2b在24 h內生長速率相當，將其分別與篩得的酵母菌復配進行發(fā)酵預試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵得到的米發(fā)糕的感官品質差異不明顯，因此選用其中1株乳酸菌作為米發(fā)糕發(fā)酵劑復配菌株之一。在0～10 h時J-2a生長速率明顯快于J-1a，2株酵母菌大致在10 h后進入穩(wěn)定期，其中J-2a在穩(wěn)定期內的OD 值高于J-1a。雖然矮小假絲酵母常存在于發(fā)酵食品中且被認為是酸面團中較為常見的一種酵母菌[15]，但在中國諸多發(fā)酵米漿中微生物菌系的研究中未見報道。有研究[16]表明矮小假絲酵母和釀酒酵母均具有較快的產氣速率，但兩者單獨發(fā)酵所得饅頭的主要揮發(fā)性成分種類不同。因此選擇R-2b(植物乳桿菌Lactobacillusplantarum)、J-1a(矮小假絲酵母Candidahumilis)及J-2a(釀酒酵母Saccharom-ycescerevisiae)復配制作米發(fā)糕三菌復合發(fā)酵劑。

表2 乳酸菌、酵母菌菌落及菌株形態(tài)特征

2.3 復配菌比對米發(fā)糕感官品質的影響

5組不同復配菌比所得米發(fā)糕的感官評價結果見圖3、 4。在形態(tài)方面，2號米發(fā)糕內部孔洞細密均勻，其他4組米發(fā)糕內部孔洞大小及分布不均且都不如2號米發(fā)糕蓬松；在香氣和滋味方面，2號米發(fā)糕相較于其他4組米發(fā)糕，具有柔和的發(fā)酵風味和醇香且酸甜適中；在口感和色澤方面，5組米發(fā)糕差異不明顯?？赡苁遣煌瑥团渚葧绊懡湍妇漠a氣能力，使得米發(fā)糕的內部組織產生差異，同時不同復配菌比會影響到微生物產生的酶及代謝產物對大米淀粉、蛋白質等成分的作用，導致米發(fā)糕在氣味、滋味方面有較大變化[17]。綜合感官評價各項指標可得到2號復配體積比R-2b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6得到的米發(fā)糕的感官得分最高。

圖2 乳酸菌、酵母菌生長曲線

圖3 三菌復配米發(fā)糕感官評價單項指標評分

Figure 3 The singer index score of the rice steamed sponge cake by three strains compounded

2.4 復配菌比對米發(fā)糕質構特性的影響

根據(jù)表3可知，5組不同復配菌比發(fā)酵得到的米發(fā)糕在回復性上無顯著性差異(P>0.05)，在彈性和內聚性上僅3號和5號有顯著性差異(P<0.05)，因此選擇硬度、膠著性和咀嚼性評價米發(fā)糕的質構品質。米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性與米發(fā)糕的品質呈負相關[18]。隨著釀酒酵母占比的增加，米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性先減小后增大，當植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母的體積比為1∶3∶6時，米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性均最小，說明該復配菌比有利于菌株間協(xié)同發(fā)酵作用，可以改善米發(fā)糕的質構品質。

1～5對應復配菌比組號1～5號

2.5 發(fā)酵劑對米發(fā)糕揮發(fā)性風味物質的影響

采用HS-SPME-GC-MS法分析4種米發(fā)糕的揮發(fā)性風味物質(樣品1：發(fā)酵劑為植物乳桿菌與矮小假絲酵母按1∶9的體積比復配；樣品2：發(fā)酵劑為植物乳桿菌與釀酒酵母按1∶9的體積比復配；樣品3：發(fā)酵劑為植物乳桿菌、釀酒酵母和矮小假絲酵母按1∶3∶6的體積比復配；樣品4：市售老漿發(fā)酵米發(fā)糕)。

由表4、5可知，4種米發(fā)糕中共同檢出的風味物質有5種，包括苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、十四烷和棕櫚酸乙酯。4種樣品中相對含量最多的均為醇類，主要是苯乙醇，這與吳鵬[9]49研究的結果一致，苯乙醇具有新鮮面包香及玫瑰香，是米發(fā)糕、饅頭的重要呈香物質[19-20]。

表3 不同菌比米發(fā)糕的質構及感官評價結果?

? 同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。

樣品1、2、3及4中分別檢出16，17，29，13種揮發(fā)性風味物質，不同樣品中的風味物質有所差異，主要表現(xiàn)在酸類、醇類、醛類、酯類等物質上。樣品1中酸類和醛類的相對含量明顯高于樣品2中的，但其醇類物質的相對含量明顯低于樣品2的，其中乙酸、苯乙醛以及樣品2中特有的2,3-丁二醇是造成差異的主要原因，可能是發(fā)酵所用的酵母菌不同引起的。盡管樣品1、2中醇類和酸類的相對含量都較高，但酯類物質的含量均較低，由此可知醇類與酸類物質的含量并不與酯類物質的含量呈正比[21]。與樣品1、2相比，樣品3中酸類和醇類物質的相對含量明顯減少，但酯類物質相對含量和種類顯著增加，可能是矮小假絲酵母菌和釀酒酵母菌之間存在協(xié)同作用促進了酯類物質的生成。酯類物質的閾值較低是影響食品風味的重要成分[22]，樣品1、2和3中共同檢出了4種酯類物質，包括乙酸苯乙酯(玫瑰香和果香[22])、癸酸乙酯(葡萄香氣)、辛酸乙酯和棕櫚酸乙酯(花果香、奶香[23])。此外，樣品3中還檢出9種特有的酯類物質，包括棕櫚酸甲酯(微弱的蠟香、果香和奶油香[23])、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞油酸乙酯(均具有油脂香氣[23])以及α-戊基-γ-丁內酯(果香)等。這些酯類物質可賦予米發(fā)糕果香和奶香。

與樣品3相比，市售米發(fā)糕中醛類和呋喃類物質的相對含量更多，但酸類和酯類物質的種類和相對含量明顯減少，可能是2種樣品發(fā)酵時微生物體系有較大差異(如菌種組成及菌比的不同)造成的。此外，對樣品3、4進行感官評價，結果見表6。樣品3的感官得分高于樣品4，同時受試人員反映三菌復合發(fā)酵得到的米發(fā)糕酸甜適宜并有回味，香氣適宜且具有柔和的發(fā)酵味和醇香味，而市售米發(fā)糕的滋味略偏酸，香氣較淡。結合GC-MS測定結果可知，與其他3種米發(fā)糕相比，三菌復合發(fā)酵劑得到的米發(fā)糕所含的揮發(fā)性風味物質種類更為豐富，但這些風味物質與產品香氣、滋味的關系還有待進一步研究。

圖5 4種米發(fā)糕GC-MS總離子流圖

表4 米發(fā)糕揮發(fā)性風味成分及含量?

? “—”為未檢出。

表5 不同米發(fā)糕樣品中揮發(fā)性風味物質類別統(tǒng)計結果

表6 與市售樣品的感官品質對比

3 結論

本試驗從四川雅安地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵米漿中篩選得到3株能夠復配用于米發(fā)糕發(fā)酵的菌株，經測序分析確定分別為植物乳桿菌、釀酒酵母菌和矮小假絲酵母菌。研究發(fā)現(xiàn)當三菌復配體積比為R2-b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6時，發(fā)酵得到的米發(fā)糕具有最優(yōu)的感官品質和質構特性，并由GC-MS檢測到29種揮發(fā)性風味物質，與雙菌復合發(fā)酵劑和老漿發(fā)酵的米發(fā)糕相比，該種米發(fā)糕所含的風味物質更為豐富，尤其是酯類物質，同時與市售米發(fā)糕相比，其還具有更優(yōu)的感官品質?；谝陨涎芯?，植物乳桿菌、釀酒酵母菌及矮小假絲酵母菌作為復合發(fā)酵劑可用于米發(fā)糕的生產。

本試驗還對比分析了2種酵母菌對米發(fā)糕風味的影響，補充了矮小假絲酵母菌在米發(fā)糕中應用的研究。但植物乳桿菌、釀酒酵母菌及矮小假絲酵母菌對米發(fā)糕風味物質影響的機理，還有待進一步研究。