李慧婷 趙杰 李海泉 施萍 張衍民 杜永亮

徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,徐州221006

支氣管哮喘(哮喘)患者氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell,ASMC)呈現(xiàn)病理狀態(tài),表現(xiàn)為高增殖性、高收縮性及高分泌性[1],是參與哮喘發(fā)病的重要細(xì)胞。其高分泌性表現(xiàn)為在炎癥因子作用下分泌大量炎癥因子[如IL-6、IL-8、IL-13及嗜酸粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)]及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等[2],這些炎癥介質(zhì)可導(dǎo)致氣道炎癥持續(xù)及級(jí)聯(lián)放大,反過來作用于ASMC,致其增殖增加及收縮增強(qiáng),參與哮喘發(fā)病。我們前期研究發(fā)現(xiàn)莫西沙星可抑制大鼠ASMC 炎癥因子IL-8 及Eotaxin的分泌[3],但具體機(jī)制尚不清楚。小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在氣道炎癥中擔(dān)當(dāng)著重要角色[4],且哮喘患者Cav-1水平明顯下調(diào)[5],提示Cav-1對(duì)氣道炎癥具有保護(hù)作用。本研究旨在探討莫西沙星對(duì)ASMC的Cav-1蛋白及mRNA 表達(dá)的影響,探索莫西沙星對(duì)ASMC 抗炎作用發(fā)揮的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 莫西沙星(德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司),Cav-1 人抗山羊單克隆抗體(16447-1-AP,美國proteintech公司),二抗山羊抗兔IgG H & L(HRP)(ab6721,英國abcam 公司),胎牛血清(中國上海徠創(chuàng)生物科技有限公司),大鼠[中國,徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房,動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(蘇)2016-0028],熒光定量檢測(cè)試劑盒(RR420A,中國上海馳勇生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組 用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為正常組(10 只),哮喘組(30只),適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2.2 哮喘大鼠模型制備 將30只哮喘組大鼠應(yīng)用雞卵蛋白腹腔注射(1 mg)及間斷霧化吸入3次(30 min)的方式復(fù)制哮喘大鼠模型,正常組大鼠應(yīng)用同等量生理鹽水干預(yù),方法同前[6]。

1.2.3 ASMC 的培養(yǎng)及傳代 無菌摘取正常組及哮喘組大鼠氣管,貼壁法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng),以胰酶消化法進(jìn)行ASMC 傳代并自然純化細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)取5～6代細(xì)胞,方法同前[7]。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Cav-1蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)細(xì)胞分為正常組作為空白對(duì)照組(A 組),哮喘組分為哮喘對(duì)照組(B 組)、莫西沙星干預(yù)哮喘組(C組)、地塞米松干預(yù)哮喘組(D 組)。A 組用正常血清培養(yǎng)細(xì)胞,B、C、D 組用致敏血清培養(yǎng),方法同前[3]。A、B 組用生理鹽水處理細(xì)胞,C 組應(yīng)用莫西沙星(5 mg/L)處理細(xì)胞,D 組應(yīng)用地塞米松處理細(xì)胞,培養(yǎng)ASMC 48 h,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后雜交,一抗為Cav-1人抗山羊單克隆抗體,二抗為山羊抗兔IgG,以NBT/BCIP顯色。條帶灰度用Image J軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.2.5 qRT-PCR 定量檢 測(cè) Cav-1 m RNA 表達(dá)

1.2.5.1 細(xì)胞RNA 提取 前期處理細(xì)胞方法同上(1.2.3),干預(yù)ASMC 48 h后,在細(xì)胞液中加入TRIzol試劑,提取細(xì)胞RNA。檢測(cè)RNA 純度,結(jié)果顯示OD260/280 比值在1.8～2.0之間,表明無RNA 降解,無蛋白污染。

1.2.5.2 cDNA 的合成 取總RNA 提取物加入隨機(jī)引物、緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶等,混勻后在42 ℃溫浴2 h,94 ℃,5～10 min,待逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成之后,將cDNA 保持在-20 ℃冰箱備用。

1.2.5.3 qRT-PCR 反應(yīng) 目的基因及內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì),先從中查找相應(yīng)基因的序列,在引物設(shè)計(jì)軟件中設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,引物序列如下：Caveolin-1,上游5'-GCGACCCTAAACACCTCAAC-3',下游5'-ATGCCGTCAAAACTGTGTGTC-3'；β-actin,上 游 5'-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3',下 游 5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3'；Cav-1擴(kuò)增片段為138 bp,β-actin擴(kuò)增101 bp。將PCR 反應(yīng)體系置于離心機(jī)以4 ℃、5 500 r/min,離心半徑6 cm,離心5 min,上機(jī),循環(huán)程序：95 ℃,2min；95 ℃,15 s；60 ℃,50 s；40 個(gè)循環(huán)。

1.2.5.4 數(shù)據(jù)的分析 首先將實(shí)驗(yàn)所有的基因Ct值整理好,之后每一組樣本自身的目的基因Ct值減去自身內(nèi)參基因Ct值,得到的數(shù)就是△Ct。換成公式就是：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。用本次實(shí)驗(yàn)研究樣本的△Ct減去對(duì)照組樣本的△Ct 并同時(shí)對(duì)結(jié)果取相反數(shù),結(jié)果就是-△△Ct。最后,對(duì)-△△Ct進(jìn)行2 的冪運(yùn)算,即2-△△Ct就得出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組靶基因的轉(zhuǎn)錄倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用。2組數(shù)據(jù)之間的比較使用Student-t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ASMC 形態(tài)鑒定 倒置顯微鏡下,培養(yǎng)的ASMC呈梭形,平行生長(zhǎng),束狀排列,密集與稀疏處相互交錯(cuò)呈 “峰谷狀”(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定圖 ×400

2.2 ASMC 免疫組織化學(xué)法鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)法表明,抗平滑肌-actin抗體呈陽性染色即胞漿內(nèi)可見大量綠色熒光,證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞是ASMC(圖2)。

圖2 免疫熒光顯微鏡法示AMSC細(xì)胞發(fā)綠色熒光 ×400

2.3 莫西沙星對(duì)ASMC Cav-1蛋白表達(dá)的影響B(tài)組[(1.16±0.05)]Cav-1蛋白表達(dá)量均較A、C、D 組[Cav-1 蛋白表達(dá)量分別為(3.56±0.05)、(2.86±0.11)、(3.01±0.17)]降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。C組與D 組之間Cav-1 蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3、4。

圖3 Western blot檢測(cè)ASMC Cav-1蛋白電泳圖

圖4 莫西沙星對(duì)ASMC Cav-1蛋白表達(dá)的影響

2.4 莫西沙星對(duì)ASMC Cav-1 m RNA 表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示B 組[(1.00±0.11)]Cav-1 mRNA 表達(dá)量均較 A、C、D 組[m RNA 表達(dá)量分別為(3.26±0.22)、(2.68±0.11)、(2.93±0.05)]降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05),C 組與D 組之間Cav-1蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖5。

3 討論

哮喘患者ASMC 呈現(xiàn)病理狀態(tài)[1],在哮喘發(fā)病中充當(dāng)著促炎細(xì)胞及主要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞雙重角色[8],其量的增加是哮喘患者大氣道進(jìn)行性狹窄的主要原因[9],與重癥及難治性哮喘發(fā)病密切相關(guān)[10]。因此,尋找針對(duì)ASMC 發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的藥物及作用機(jī)制可能將為重癥及難治性哮喘的控制及治療提供新的思路。

圖5 莫西沙星對(duì)ASMC Cav-1 mRNA 表達(dá)的影響

我們已證實(shí)莫西沙星可以直接作用于大鼠ASMC,干擾ASMC 增殖[11]、誘導(dǎo)凋亡[7]及抑制炎癥因子分泌[3],本實(shí)驗(yàn)中莫西沙星可以直接干預(yù)大鼠ASMC并影響ASMC形態(tài)及數(shù)量,這與我們既往結(jié)論一致。

莫西沙星可對(duì)多種細(xì)胞發(fā)揮抗炎調(diào)節(jié)作用[3,12],但其具體作用機(jī)制尚不清楚。Cav-1作為支架蛋白構(gòu)成細(xì)胞表面穴樣內(nèi)陷(Caveolae)介導(dǎo)胞吞,其可通過抑制一氧化氮生成[13]及影響ASMC內(nèi)鈣離子濃度在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[14],但莫西沙星對(duì)哮喘氣道炎癥的保護(hù)作用是否與Cav-1相關(guān)少有研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大鼠ASMC 中存在Cav-1 蛋白及 m RNA 表達(dá)。哮喘組 ASMC Cav-1 蛋白及m RNA 表達(dá)量均較正常組明顯降低,提示Cav-1可能在哮喘性氣道炎癥中擔(dān)當(dāng)保護(hù)作用,與既往結(jié)論一致[14]。應(yīng)用莫西沙星或地塞米松干預(yù)哮喘組ASMC 后,結(jié)果顯示 2 組 ASMC Cav-1 蛋 白及m RNA 表達(dá)量均較哮喘對(duì)照組明顯增加,且2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表達(dá)量,但其是否為莫西沙星抑制哮喘性大鼠ASMC 炎癥因子IL-8及Eotaxin 分泌的上游機(jī)制,尚需進(jìn)一步研究。另外,關(guān)于莫西沙星增加哮喘大鼠ASMC Cav-1蛋白及m RNA 表達(dá)量的具體機(jī)制仍未可知。

莫西沙星組織滲透性較強(qiáng),肺組織細(xì)胞內(nèi)濃度較血清中高達(dá)數(shù)倍甚至數(shù)十倍,與靜脈給藥相比,霧化吸入后氣道上皮細(xì)胞內(nèi)濃度并未明顯升高[15],主要因?yàn)榧?xì)胞存在藥物外排機(jī)制。P糖蛋白是介導(dǎo)藥物主動(dòng)外排的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對(duì)脂質(zhì)藥物最為敏感[16],莫西沙星脂溶性較強(qiáng),當(dāng)胞內(nèi)濃度較高時(shí),可上調(diào)P 糖蛋白,啟動(dòng)外排機(jī)制,防止胞內(nèi)藥物濃度過高[15]。P 糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能的發(fā)揮需要借助細(xì)胞表面Cav-1 支架蛋白的作用[17]。另外,近年來研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Cav-1可明顯提高食管鱗狀細(xì)胞癌P糖蛋白m RNA 及蛋白水平,敲減Cav-1將致P糖蛋白表達(dá)明顯下降,提示Cav-1對(duì)P糖蛋白表達(dá)具有調(diào)控作用[18]。我們推測(cè)當(dāng)莫西沙星以高濃度擴(kuò)散進(jìn)入ASMC 胞內(nèi)時(shí),P 糖蛋白首先感知刺激信號(hào),然后引起Cav-1表達(dá)水平上調(diào),Cav-1表達(dá)上調(diào)后反過來刺激P 糖蛋白表達(dá)增加,最后P糖蛋白將胞內(nèi)濃度過高的莫西沙星轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞,但具體機(jī)制尚需更多的研究。

本研究結(jié)果揭示莫西沙星可增加哮喘大鼠ASMC Cav-1的表達(dá),其可能與莫西沙星抑制哮喘大鼠氣道炎癥機(jī)制相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突