趙玉富，咸偉玥

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，哈爾濱 150050）

維生素A又稱視黃醇，在動物體內(nèi)不但起到維持正常視覺作用，還能參與性激素的形成和保護(hù)上皮細(xì)胞。維生素D3又稱膽鈣化醇，是一類與動物體內(nèi)鈣、磷代謝相關(guān)的活性物質(zhì)，能促進(jìn)動物消化道對鈣、磷的吸收。維生素E是一類具有生物活性的酚類物質(zhì)，在動物體內(nèi)能起到調(diào)節(jié)細(xì)胞核的代謝功能，促進(jìn)性腺發(fā)育和提高生殖能力。維生素A、維生素D3和維生素E都是脂溶性維生素，傳統(tǒng)飼料維生素A、維生素D3和維生素E的檢測分為三個標(biāo)準(zhǔn)，過程繁瑣[1-3]。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A和維生素E可以同時檢測[4]。傳統(tǒng)檢驗方法的檢驗效率很低并且過程試劑消耗量大。

二維液相色譜采用色譜柱串聯(lián)技術(shù)使得樣品待測組分在一維色譜柱中得到分離，并通過閥切換模式使得其中一種或多種待測組分進(jìn)入二維色譜柱中進(jìn)一步分離，從而實現(xiàn)在復(fù)雜基質(zhì)中排除干擾物質(zhì)的在線凈化分析過程[5-7]。近年二維液相色譜技術(shù)為復(fù)雜體系中維生素A、維生素D3和維生素E提供了新的思路，并且在實際應(yīng)用方面針對于嬰幼兒配方乳粉的多種脂溶性維生素檢測中使用中心切割法代替正相分離凈化維生素D3取得較好的效果，在飼料檢測方面應(yīng)用報道較少[8-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

二維液相色譜系統(tǒng)及其色譜工作站（1260 Infinity-2D，Agilent Technologies美國），配備雙二極管陣列檢測器（DAD），電子分析天平（BSA 2202S 0.01g、BT 25S 0.01 mg賽多利斯），超聲波清洗器（KH-500DE，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），維生素A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度97.80%，Dr Ehrenstorfe），維生素D3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.97%，Dr Ehrenstorfe），維生素Edl-α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度98.50%，Dr Ehrenstorfe），甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），試驗用水為超純水。維生素復(fù)合預(yù)混合飼料（市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

一維條件：Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×150 mm，2.7μm），流速為0.6 mL·min-1梯度洗脫，流動相為流動相甲醇-乙腈-水，洗脫程序見表1。一維DAD檢測器采用波長切換方式檢測（VA：326 nm；VE：285 nm；波長切換時間點為9.00 min）。

二維條件：Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH（4.6 mm×250 mm，5μm），流速為1.0 mL·min-1，流動相為甲醇。二維DAD檢測器檢測（VD3：264 nm），柱溫均為25℃，進(jìn)樣量為10μL，閥切換時間為7.80 min更改閥的位置端口1-＞6，8.90 min更改閥的位置端口1-＞2。捕獲柱為SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。

表1 一維液相梯度洗脫程序

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取一定量的VA、VE、VD3標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻。經(jīng)校正VA貯備液濃度為500μg·mL-1，VE標(biāo)準(zhǔn)貯備液濃度為1.0 mg·mL-1，VD3貯備液濃度為100μg·mL-1。分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液適量，制成混合工作液，VA工作液濃度為20.0μg·mL-1，VE標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為200μg·mL-1，VD3工作液濃度為4.0μg·mL-1。將維生素A、E、D3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.2.3 樣品測定

稱取飼料10 g（精確至0.0001 g）于250 mL圓底燒瓶中，再加入5 g·L-1抗壞血酸-乙醇溶液100mL，500g·L-1氫氧化鉀溶液20mL，溫度80℃，磁力攪拌回流皂化30 min。將皂化液移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取2次，100 mL·次-1，合并萃取液，萃取液以水洗滌至中性，收集石油醚層，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中。40℃旋蒸至近干，取下氮氣吹干，再以甲醇溶解并轉(zhuǎn)移定容至10 mL作為待測液。

2 試驗結(jié)果

2.1 二維液相色譜的建立與閥切換時間的確定

VA和VE飼料中含量較高，VD3含量較低，且樣品基質(zhì)干擾較大，原標(biāo)準(zhǔn)方法需經(jīng)過正相制備色譜的凈化，將含有VD3的餾分蒸干定容后，再在反相色譜上進(jìn)行分析。本研究采用二維色譜分離的中心切割法，樣品在一維色譜柱實現(xiàn)初步分離后，將含有VD3的餾分切割至二維色譜柱中進(jìn)行分離。系統(tǒng)連接圖見圖1。為確定閥的準(zhǔn)確切換時間，實驗將關(guān)閉閥切換命令使一維色譜柱直接與一維檢測器連接，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測定VD3的出峰時間起點和終點。由于使用捕獲柱收集一維色譜柱的VD3的餾分，而捕獲柱柱容量小，需要考慮在閥切換的時間段內(nèi)捕獲柱是否能完全將VD3收集到。

由圖1可知，影響VD3是否被完全收集的因素主要是一維色譜柱對VD3的分離效果和一維泵系統(tǒng)的流速設(shè)計，實驗中我們內(nèi)徑3.0 mm、填料粒徑2.7μm的一維色譜柱，流速為0.6 mL·min-1，由標(biāo)準(zhǔn)品測試確定出閥切換時間為7.80 min更改閥的位置端口1→6，8.90 min更改閥的位置端口1→2。

圖1 二維液相閥切換流路

2.2 方法線性范圍與精密度

按照1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線配制VA、VD3、VE標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對已知濃度的維生素VA、VD3、VE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，以三者的峰面積計算方法精密度，VA、VE、VD3峰面積六次測定的RSD分別為1.0%、1.3%和0.5%，方法精密度良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、線性方程及精密度見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系與精密度

圖2 維生素A、維生素D3和維生素E標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品分析結(jié)果

按照1.2.3樣品測定方法對飼料樣品進(jìn)行分析，樣品分析譜圖見圖3。同時對實驗樣品的3種維生素做加標(biāo)實驗數(shù)據(jù)見表3。

3種維生素加標(biāo)回收率為90%～98%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高。

圖3 樣品中維生素A、維生素E、維生素D3譜圖

表3 飼料樣品測試結(jié)果與加標(biāo)實驗結(jié)果

3 討論

采用與國標(biāo)檢驗方法相同的樣品前處理方式，在色譜分離條件上采用二維色譜技術(shù)取代原有正相凈化技術(shù)，在檢驗時間上本方法實現(xiàn)了VA、VE、VD33種維生素同時檢測，在檢驗時間上相對于傳統(tǒng)檢測的正相凈化后檢測減少了三分之二，3種維生素檢測只需要15 min，并且在實際消耗方面取消了正相凈化的消耗，對于檢測機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)在儀器和人員投入大幅降低，新方法更加符合綠色化學(xué)和現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展趨勢。

4 結(jié)論

本試驗采用中心切割二維液相色譜技術(shù)建立了快速、準(zhǔn)確測定飼料中VA、VE、VD3含量的方法，實現(xiàn)了VA、VE、VD3同時檢測，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為飼料中維生素含量測定提供了參考。