譚兵，馬亞楠，張磊，李倪，劉樹(shù)業(yè)

子癇前期（pre-eclampsia，PE）是一種妊娠期常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，是指孕婦于妊娠20周后出現(xiàn)以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕卣鞯募膊?，?yán)重影響各器官的功能。PE在我國(guó)的發(fā)生率為5%～7%，嚴(yán)重危害母兒健康[1-3]。目前，終止妊娠是治療PE的唯一有效方法[4]，但較早終止妊娠不利于新生兒的健康；因此，篩查PE早期診斷標(biāo)記物，及早對(duì)PE高危孕婦進(jìn)行干預(yù)及監(jiān)護(hù)，改善其妊娠結(jié)局具有重要意義。近年來(lái)，代謝組學(xué)相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記物在PE的預(yù)測(cè)、診斷和治療中發(fā)揮著重要作用，本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ultra performance liquid chromatography-mass spectra，UPLC-MS）分析 PE 孕婦分娩前后與正常孕婦血清代謝圖譜的差異，尋找PE孕婦特征性的代謝物，探索代謝途徑異常的機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2017年9月—2018年3月天津市第三中心醫(yī)院收入院的孕婦共45例，其中PE患者（PE組）20例，年齡為（27.9±3.2）歲；正常孕婦（對(duì)照組）25例，年齡為（28.1±2.8）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為：①明確診斷為PE患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中國(guó)《妊娠期高血壓疾病診治指南（2015）》[5]；②孕周超過(guò)32周；③無(wú)慢性高血壓、心血管疾病、糖尿病、腎臟疾病、甲狀腺疾病及自身免疫病等病史；④排除雙胎妊娠及巨大兒。本研究通過(guò)天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2017073），所有納入研究的孕婦均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料的收集 記錄所有納入標(biāo)準(zhǔn)孕婦的孕周、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PlGF）、三酰甘油及總膽固醇水平。

1.2.2 血清標(biāo)本收集 分別采集PE組分娩前后和對(duì)照組孕婦清晨空腹靜脈血3 mL，置于促凝離心管中，2 500×g離心15 min后分離血清，于-80℃保存直至上機(jī)分析。

1.2.3 樣本預(yù)處理 200 μL解凍孕婦血清與600 μL甲醇混合，劇烈振蕩30 s后，4℃下靜置5 min。將混合物在4℃，離心半徑為8 cm，3 000 r/min離心15 min，取上清液用真空濃縮機(jī)蒸發(fā)至干燥狀態(tài)。400 μL超純水將蒸發(fā)后的干粉進(jìn)行復(fù)溶，充分振蕩搖勻30 s，再用2.2 μm微孔濾膜對(duì)復(fù)溶樣品進(jìn)行過(guò)濾，得到待測(cè)樣品。

1.2.4 樣本分析 ①色譜條件：Accela超高效液相色譜系統(tǒng)。采用Hypersil GOLD反相C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，色譜柱溫20℃，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸乙腈，流速為200 μL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～2.5 min，95%A 和 5%B；2.5～6.5 min，5%B～95%B；6.5～9 min，5%A和 95%B；9～13 min，95%B～5%B；13～15.5 min，95%A 和 5%B。②質(zhì)譜條件：采用正離子掃描模式，離子源電壓4.5 kV，毛細(xì)管電壓30 V，錐孔電壓150 V，去溶劑化溫度設(shè)定為350℃，鞘氣流速為 30 相對(duì)單位（arbitrary unit，ARB）（99.999%氮?dú)猓?，輔氣流速5 ARB（99.999%氮?dú)猓?。?shù)據(jù)采集貫穿于15 min的色譜洗脫過(guò)程。

1.2.5 質(zhì)量控制 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共檢測(cè)18個(gè)質(zhì)控溶液（由所有樣品等容混合后得到），樣品分析前連續(xù)分析8個(gè)質(zhì)控溶液，其余10個(gè)隨機(jī)插入到65個(gè)樣品的分析序列中。樣品分析的先后順序由Excel軟件自帶函數(shù)隨機(jī)產(chǎn)生。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 UPLC-MS分析數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入MZmine 2.0[6]軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)前處理。前處理所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+1.0.1.0[7]進(jìn)行分析，利用模式識(shí)別方法構(gòu)造主成分分析和正交偏最小二乘判別分析模型[8]，提取出變量重要性投影（variable influence on projection，VIP）值大于1的變量并棄除置信區(qū)間包含零的所有變量，根據(jù)篩選出的變量重新設(shè)定儀器參數(shù)，對(duì)質(zhì)控溶液進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得這些代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖；再利用精確質(zhì)量數(shù)（m/z）和二級(jí)質(zhì)譜圖搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)得出初步結(jié)果；最后通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)比得到鑒定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法；非正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù) [M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)計(jì)算曲線(xiàn)下面積（AUC），用以評(píng)估特征代謝物的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 2組孕婦的一般情況比較PE組三酰甘油和總膽固醇水平高于對(duì)照組，PlGF水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組孕婦的一般情況比較

2.2 代謝輪廓模型對(duì)疾病的區(qū)分能力利用模式識(shí)別方法將所得數(shù)據(jù)構(gòu)建的主成分分析模型和正交偏最小二乘判別分析模型具有很好地區(qū)分聚類(lèi)的傾向，可以很好地區(qū)分PE組和對(duì)照組。模型的第一預(yù)測(cè)主成分（t[1]）和第二預(yù)測(cè)主成分（t[2]）打分如圖1所示。第二預(yù)測(cè)主成分（t[2]）方向上，PE分娩后組（Y軸）的代謝譜在對(duì)照組與PE分娩前組之間。各組的聚類(lèi)趨勢(shì)在第二預(yù)測(cè)主成分（t[2]）方向上的變化，反映分娩后患者的代謝譜傾向于向正常孕婦轉(zhuǎn)移。

2.3 特征代謝物鑒定結(jié)果通過(guò)分析PE組分娩前后及對(duì)照組代謝輪廓的變化，提取出VIP值大于1的變量，重新設(shè)定儀器參數(shù)，對(duì)質(zhì)控溶液進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描；再利用精確質(zhì)量數(shù)（m/z）和二級(jí)質(zhì)譜圖搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，共篩選出27個(gè)特征代謝離子，其中5個(gè)通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖對(duì)比得到初步鑒定，分別是溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0、LPC 22:6、14-甲基十六烷酸、二十二酸和1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯。比較鑒定出特征代謝物相對(duì)含量，得出5種代謝物在PE組和對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。本研究同時(shí)分析了這5種潛在代謝標(biāo)記物在PE患者分娩前后的變化，溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0、LPC 22:6、14-甲基十六烷酸的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 PE分娩前后及對(duì)照組血清樣本主成分分析模型

表2 5種特征代謝物的鑒定結(jié)果

2.4 診斷效能比較應(yīng)用PE組和對(duì)照組孕婦血清5種代謝物水平制作診斷PE的ROC曲線(xiàn)，LPC 18:0、LPC 22:6、14-甲基十六烷酸、二十二酸和1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯的AUC分別為0.678（95%CI：0.513～0.843）、0.838（95%CI：0.716～0.960）、0.396（95%CI：0.228～0.228）、0.310（95%CI：0.154～0.466）和 0.250（95%CI：0.105～0.395）。LPC 18:0 和LPC 22:6的AUC大于參考曲線(xiàn)下面積，對(duì)于PE有較好的診斷價(jià)值。14-甲基十六烷酸、二十二酸和1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯三種代謝產(chǎn)物的AUC較小，這3種代謝物單獨(dú)用作PE的診斷指標(biāo)特異度和敏感度都不高，而溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0和LPC 22:6以及兩者聯(lián)合的AUC分別為0.678、0.838和0.938，大于參考曲線(xiàn)下面積，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。但溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0和LPC 22:6兩者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.292，P=0.16）。見(jiàn)圖 2。

3 討論

圖2 5種代謝物對(duì)PE診斷的ROC曲線(xiàn)

PE孕婦往往在發(fā)病早期就已出現(xiàn)病理生理改變，但是明確診斷時(shí)大多已進(jìn)展至晚期，很難進(jìn)行干預(yù)治療。因此，從孕婦血清中尋找早期診斷PE的標(biāo)記物具有重要意義。本研究通過(guò)分析PE孕婦及正常孕婦一般臨床資料發(fā)現(xiàn)，PE孕婦三酰甘油水平明顯升高，而PlGF水平則明顯降低。這與Austdal等[9]及曲光瑾等[10]的研究結(jié)論一致。另外，脂質(zhì)代謝紊亂在PE早期即可發(fā)生，被認(rèn)為是PE診斷的重要指標(biāo)[11]。本研究采用UPLC-MS技術(shù)對(duì)PE孕婦分娩前后及正常孕婦血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，鑒定出5種特征代謝物，分別是溶血磷脂酰膽堿類(lèi)（LPC 18:0、LPC 22:6）、油酸類(lèi)（14-甲基十六烷酸和二十二酸）、1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯。其中溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0、LPC 22:6和14-甲基十六烷酸在PE孕婦分娩前后的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與分娩前相比，其含量趨于正常孕婦，表明胎兒從母體分離有助于治療或緩解疾病的嚴(yán)重程度。

3.1 PlGF與PEPlGF由合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌，在胎盤(pán)血管的形成中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)受氧含量和細(xì)胞因子的影響，缺氧時(shí)表達(dá)明顯降低[12]。研究表明PlGF表達(dá)水平的異常，影響子宮胎盤(pán)血管及子宮螺旋動(dòng)脈重鑄，可能導(dǎo)致PE的發(fā)生[13]。PlGF在正常妊娠婦女中表達(dá)豐富，而在未妊娠婦女及男性血漿中含量極低甚至檢測(cè)不到[14]。正常妊娠時(shí)，不同階段PlGF水平不同，其變化曲線(xiàn)呈鐘形，妊娠早期較低，15周開(kāi)始逐漸升高，28～30周達(dá)到高峰，其后隨著孕周增加含量又逐漸下降。而對(duì)PE孕婦，妊娠早期PlGF含量與正常妊娠婦女差別不大，20周以后與正常孕婦相比才明顯降低[15-16]，因此PlGF對(duì)PE早期診斷的意義不大。但有研究顯示，PlGF在PE治療以及終止妊娠的時(shí)機(jī)中發(fā)揮了一定的指導(dǎo)作用[17-19]。

3.2 溶血磷脂酰膽堿與PE本研究中PE孕婦的血清溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)LPC 18:0、LPC 22:6水平高于正常孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），LPC 18:0和LPC 22:6兩種代謝產(chǎn)物的AUC大于參考AVC，具有較高的診斷效能。溶血磷脂酰膽堿類(lèi)物質(zhì)的變化趨勢(shì)不盡相同，可能與不同脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的生物活性有關(guān)。溶血磷脂酰膽堿是目前已知的最簡(jiǎn)單的水溶性甘油磷脂，廣泛地參與物質(zhì)脂質(zhì)代謝，特別是磷脂代謝途徑。溶血磷脂酰膽堿是磷脂代謝的重要產(chǎn)物，是氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的主要成分。長(zhǎng)期以來(lái)其被認(rèn)為是細(xì)胞膜的組成部分和磷脂合成的先驅(qū)物。溶血磷脂酰膽堿還可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的吞噬作用而增加黏附分子的表達(dá)，并具有促進(jìn)細(xì)胞骨架變化和調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移能力的作用[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酰膽堿在多種組織和細(xì)胞中具有廣泛的生物學(xué)功能，被稱(chēng)為細(xì)胞間的“多功能磷脂信使”[21]。溶血磷脂酰膽堿作為早期血脂異常的新標(biāo)記物，參與PE的發(fā)生、發(fā)展，有望為該病的預(yù)測(cè)和診療提供更多的理論依據(jù)。

3.3 油酸與PE油酸是膜磷脂、三酰甘油、膽固醇酯等的主要組分[22]。研究表明油酸能夠誘導(dǎo)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)并激活多種轉(zhuǎn)錄因子如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和S6，從而影響胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、增殖、分化及凋亡，影響胎盤(pán)功能[23]。此外，Yang等[24]的研究也得出同樣結(jié)論，且指出油酸有望成為預(yù)測(cè)PE的潛在血清學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果表明PE孕婦血清油酸（14-甲基十六烷酸和二十二酸）含量顯著低于正常孕婦，但這兩種代謝物的AUC較小，特異度和敏感度均較低，這可能是因?yàn)橛退犷?lèi)物質(zhì)含量容易受多種因素的影響或者是本研究樣本量太少，因此下一步研究應(yīng)增加樣本量檢測(cè)不同疾病狀態(tài)該物質(zhì)含量的多少，為PE篩查潛在血清標(biāo)記物提供更加準(zhǔn)確的理論基礎(chǔ)。

3.4 1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯與PE1，25-二羥基維生素D3是體內(nèi)維生素D最重要的活性代謝物。維生素D本身沒(méi)有生物活性，只有其活性形式1，25-二羥基維生素D3可以發(fā)揮其生理作用。孕婦維生素D缺乏會(huì)增加PE的風(fēng)險(xiǎn)[25-27]。維生素D能有效地預(yù)防或延緩子癇的發(fā)生，這與維生素D引起的各種免疫應(yīng)答（細(xì)胞和體液）有關(guān)；由于維生素D的減少，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞缺陷，導(dǎo)致調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞不適當(dāng)?shù)奶ケP(pán)植入，進(jìn)一步有助于胎盤(pán)釋放血管收縮因子，臨床表現(xiàn)為妊娠高血壓和蛋白尿[28]，且有研究表明PE組孕婦血清1，25-二羥基維生素D3水平均低于正常妊娠組，血清1，25-二羥基維生素D3水平降低與PE的發(fā)病相關(guān)，且血清1，25-二羥基維生素D3水平降低早于PE臨床癥狀出現(xiàn)[29]。1，25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯是CYP24A1在1，25-二羥基維生素D3的位置23羥基化后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有維持體內(nèi)鈣和磷代謝平衡的作用，其含量降低增加了孕婦發(fā)生的子癇風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床上應(yīng)注意孕期補(bǔ)充維生素D，并監(jiān)測(cè)孕婦維生素D的代謝途徑，降低子癇的風(fēng)險(xiǎn)。此外，有研究表明PE孕婦胎盤(pán)中維生素D受體的表達(dá)水平降低，低于正常孕婦。維生素D受體與1，25-二羥基維生素D3結(jié)合并調(diào)節(jié)基因，從而影響PE，這可能與維生素D受體基因多態(tài)性有關(guān)[30]。

綜上所述，雖然溶血磷脂酰膽堿、油酸和1,25-二羥基維生素D3-26，23內(nèi)酯等已經(jīng)揭示了機(jī)體代謝紊亂的病理生理基礎(chǔ)，顯示出一定的潛在應(yīng)用價(jià)值，但由于實(shí)驗(yàn)中樣本數(shù)量限制，仍需大樣本量的臨床驗(yàn)證。鑒于PE發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，因此聯(lián)合應(yīng)用多項(xiàng)可反映疾病發(fā)生、發(fā)展不同方面的指標(biāo)，可提高預(yù)測(cè)的效果。目前代謝組學(xué)關(guān)于PE的研究仍處于初級(jí)階段，為更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價(jià)值，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及檢測(cè)范圍，聯(lián)合不同代謝物檢測(cè)及其他理化檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高代謝組學(xué)在預(yù)測(cè)、診斷及治療PE中的作用。