何 勇，張曉虎，張峻偉

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000)

引言

藥用植物連翹〔Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl〕果實(shí)中含有豐富的揮發(fā)性精油，其化學(xué)組成主要有單萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、三萜類(lèi)、萜醇類(lèi)以及環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物，α-蒎烯和β-蒎烯的含量占揮發(fā)油總量的60%以上，此外，還有含硫和含氮的化合物。因此，連翹果實(shí)精油化學(xué)成分比較復(fù)雜且具有多種生物學(xué)功能，如抑菌消炎、抑制病毒、抗氧化等。連翹精油作為具有潛力的一種新型天然食品防腐物，由于對(duì)食品風(fēng)味的影響小、價(jià)格適中，已成為現(xiàn)代食品添加劑領(lǐng)域研究的重要課題［1-7］。

傳統(tǒng)的連翹藥用部位是其果殼，而富含精油的占果實(shí)重約1/3 的種子往往被廢棄，造成資源浪費(fèi)。陜西省商洛市是中國(guó)連翹主產(chǎn)區(qū)之一，野生、撫育及栽培的連翹面積、產(chǎn)量大，提取果實(shí)精油有利于促進(jìn)當(dāng)?shù)剡B翹資源的綜合利用［8］。研究以商洛連翹為對(duì)象，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化超臨界CO2萃取連翹果實(shí)精油工藝，將連翹精油萃取物用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性試驗(yàn)，以荔枝貯藏試驗(yàn)檢驗(yàn)連翹精油的保鮮效果，欲為萃取商洛連翹精油并用于食品保鮮提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 材料:連翹果實(shí)，2018 年10月采于商洛市商州區(qū)金鳳山;新鮮荔枝，2019 年5月購(gòu)于商洛市商州區(qū)五洲超市。

試劑:CO2(食品級(jí)，純度＞99%，購(gòu)于成都市緣和基業(yè)化工有限責(zé)任公司);95%乙醇(分析純);蒸餾水。

菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(FS180-4 型，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司);超臨界CO2萃取設(shè)備(WH890HA220-40-11 型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9123A 型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 原料預(yù)處理 連翹果實(shí)沖洗后于60℃干燥至恒重，粉碎后過(guò)60 目篩，稱(chēng)取若干份(每份10 g)，用紗布包裹分裝，密封待用。

1.2.2 連翹精油萃取 用CO2為萃取劑的超臨界萃取連翹果實(shí)精油過(guò)程包括流體的壓縮、萃取、減壓和分離等，其中分離器中CO2通過(guò)凈化后再壓縮，重新回到CO2壓縮機(jī)中，實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用。

將包裹分裝的預(yù)處理后的連翹樣品置于萃取釜中，以CO2反復(fù)沖洗萃取釜，排盡其中空氣后進(jìn)行萃取，最后分離出CO2流體以獲得連翹果實(shí)精油。準(zhǔn)確稱(chēng)量萃取物，按式(1)計(jì)算連翹精油的萃取率(Y)。

式中:m1為連翹萃取物的質(zhì)量，g;m0為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

(1)萃取溫度對(duì)萃取率的影響

由于溶劑CO2的臨界溫度為31.6℃，萃取時(shí)的溫度需高于此臨界溫度，故設(shè)定條件為:萃取用時(shí)90 min、萃取壓力23 MPa、以濃度60%的乙醇為夾帶劑，探究不同萃取溫度(32、37、42、47、52、57℃)對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率的影響。

(2)萃取壓力對(duì)萃取率的影響

由于溶劑CO2的臨界壓力為7.39 MPa，萃取時(shí)的壓力需高于此臨界壓力，故設(shè)定條件為:萃取用時(shí)90 min、萃取溫度32℃、以濃度60%的乙醇為夾帶劑，探究不同萃取壓力(8、13、18、23、28、33 MPa，萃取壓力最高不得超過(guò)35 MPa)對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率的影響。

(3)萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

在設(shè)定萃取壓力23 MPa、萃取溫度32℃和乙醇夾帶劑濃度60%的條件下，探究不同萃取時(shí)間(30、45、60、75、90、105 min)對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率的影響。

(4)乙醇夾帶劑濃度對(duì)萃取率的影響

在設(shè)定萃取壓力23 MPa、萃取溫度32℃和萃取時(shí)間90 min 的條件下，探究不同乙醇夾帶劑濃度(0、20、40、60、80、100%)對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)，選取3 個(gè)影響較顯著的因子，每因子設(shè)置3 個(gè)水平，采用L9(33)正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.5 抑菌效果試驗(yàn)

(1)培養(yǎng)基的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量定量的瓊脂粉于250 mL 錐形瓶中，加入蒸餾水，用軟木塞堵塞瓶子，用牛皮紙包裹瓶子，用細(xì)繩擰緊，經(jīng)混合充分，高壓滅菌處理，以獲得無(wú)菌培養(yǎng)基。

(2)菌懸液的制備

在裝有9 mL 蒸餾水的試管中加入適量活化的供試細(xì)菌，混合充分制備細(xì)菌懸浮液，在試管中加入1 mL 完全混合的細(xì)菌懸浮液，加入蒸餾水制作不同濃度的細(xì)菌懸浮液。采用平板計(jì)數(shù)法，將濃度調(diào)到含菌體數(shù)106～107個(gè)/mL 的菌懸液，備用。

(3)抑菌圈的測(cè)定

濾片抑菌圈測(cè)定采用瓊脂擴(kuò)散法［9］。首先，將少量的連翹精油溶解在無(wú)水乙醇中，分別制備成質(zhì)量百分比為0.5、1.0、2.0%的溶液，然后將濃度為1 ×105cfu/mL 細(xì)菌懸浮液均勻地涂在固化表面培養(yǎng)皿中，蓋好平皿。將滅菌的直徑為6 mm 濾紙浸泡在上述3 種含有連翹精油成分的乙醇溶液中，濾紙用無(wú)菌鑷子夾起，等待1～2 min。干燥后輕輕貼在平板的表面上，每個(gè)板材貼紙3片，以無(wú)菌水為對(duì)照，在37℃下恒溫培養(yǎng)48 h 后測(cè)量，結(jié)果為三次測(cè)量之平均值。

1.2.6 連翹果實(shí)精油對(duì)荔枝保鮮效果的指標(biāo)測(cè)定 取無(wú)損壞、無(wú)病蟲(chóng)且大小均勻，未經(jīng)防腐劑處理的新鮮荔枝，隨機(jī)分成四組。將荔枝分別在含有連翹果實(shí)精油0.5、1.0、2.0%的乙醇溶液和蒸餾水中浸泡3 min，取出后放置在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)處晾干，置于一次性消毒塑料盒中，室溫下在紙箱中存放，以蒸餾水處理為對(duì)照組，貯藏期間取樣一次的時(shí)間間隔為1 d/次，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，重復(fù)三次，按式(2)計(jì)算失重率。

采用糖度計(jì)法測(cè)量荔枝漿中可溶性固體含量［10］，儀器經(jīng)校正后，在棱鏡玻璃表面滴下2 滴荔枝汁，觀察，讀取在光暗交匯處線上的刻度，即荔枝的可溶性固形物含量(%)，試驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

圖1 萃取溫度對(duì)萃取率的影響

2.1.1 萃取溫度對(duì)萃取率的影響 分析圖1 可知，47℃以下隨溫度的升高萃取率顯著提高，但當(dāng)溫度超過(guò)47℃時(shí)，連翹果實(shí)精油萃取率明顯下降?？赡苁怯捎跍囟鹊陀?7℃，萃取溫度的不斷升高，CO2 分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，從而會(huì)造成流體粘度降低，進(jìn)而使流體可以迅速地?cái)y帶連翹果實(shí)精油，因此顯示出圖中的上升趨勢(shì);當(dāng)溫度超過(guò)47℃以后，繼續(xù)升高溫度時(shí)，使得流體密度變小，其攜帶連翹果實(shí)精油的能力降低，所以顯現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。故選擇47℃為試驗(yàn)的較佳萃取溫度。

2.1.2 萃取壓力對(duì)萃取率的影響 分析圖2 可知，當(dāng)萃取壓力小于23 MPa 時(shí)，連翹果實(shí)精油的萃取率隨萃取壓力的增加而升高，但是當(dāng)萃取壓力超過(guò)23 MPa 時(shí)，萃取率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)?？赡芤环矫媸怯捎趬毫υ黾訒r(shí)，使得超臨界流體的密度增加，流體攜帶連翹果實(shí)精油的能力提高;另一方面是由于壓力過(guò)高時(shí)，超臨界流體密度過(guò)大，反而阻礙了傳質(zhì)的效率，所以，萃取壓力在23 MPa 后，繼續(xù)增壓，連翹果實(shí)精油的萃取率反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。故選擇23 MPa 為試驗(yàn)的較佳萃取壓力。

圖2 萃取壓力對(duì)萃取率的影響

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

分析圖3 可知，隨著萃取時(shí)間的增加，萃取率始終保持升高趨勢(shì)，但從萃取率升高的幅度觀察，當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)90 min 后，其萃取率的增幅明顯降低，從能耗的角度來(lái)看，萃取時(shí)間越長(zhǎng)，能耗越多，考慮到節(jié)能和經(jīng)濟(jì)效益，故選擇90 min 為試驗(yàn)的較佳萃取時(shí)間。

2.1.4 乙醇夾帶劑濃度對(duì)萃取率的影響 分析圖4 可知，隨著濃度的增加，萃取率先升高后降低，當(dāng)乙醇夾帶劑濃度為60%時(shí)萃取率最高，繼續(xù)增加乙醇夾帶劑濃度，則其萃取率明顯降低。原因可能是，連翹精油溶于乙醇，隨濃度的增大，導(dǎo)致溶液極性變化，使連翹精油溶解度下降，萃取率降低。故選擇60%為試驗(yàn)較佳的乙醇夾帶劑濃度。

圖4 乙醇夾帶劑濃度對(duì)萃取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析 以連翹精油萃取率為指標(biāo)，取單因素試驗(yàn)中萃取的時(shí)間、壓力、溫度3 個(gè)影響較大因素，每因素設(shè)置3 個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見(jiàn)表2。

表2 直觀分析可知:對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率影響最大的因素是C(萃取時(shí)間);影響次之的是因素A(萃取壓力);影響最小的因素是B(萃取溫度)。綜合分析可得最優(yōu)組合:A1B3C3，即萃取壓力為23 MPa，萃取溫度為52℃，萃取時(shí)間為90 min。

2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析 經(jīng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理，得出正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3 分析可知，因素C 對(duì)應(yīng)的F 比為2.246＜5.140，可得因素C(萃取時(shí)間)對(duì)連翹果實(shí)精油的萃取率影響顯著;因素A 對(duì)應(yīng)的F 比為0.603＜5.140，可得因素A(萃取壓力)對(duì)連翹果實(shí)精油的萃取率影響較為顯著;因素B 對(duì)應(yīng)的F 比為0.151(0.151 ＜0.603 ＜2.246 ＜5.140)，可得因素B(萃取溫度)對(duì)連翹果實(shí)精油萃取率影響不顯著。綜合分析可得:超臨界CO2萃取連翹果實(shí)精油的最佳工藝條件是A1B3C3，即萃取壓力為23 MPa，萃取溫度為52℃，萃取時(shí)間為90 min。由此看出，正交分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，在此條件下連翹果實(shí)精油萃取率為0.58%。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果與分析

萃取的商洛連翹果實(shí)精油抑菌結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可得，0.5%的連翹精油就有抑菌效果，2.0%的連翹精油對(duì)金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為15.6 mm，對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈直徑10.2 mm。表明連翹果實(shí)精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果大于對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌效果。

表4 連翹精油抑菌結(jié)果

2.4 保鮮試驗(yàn)結(jié)果與分析

圖5 失重率指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.4.1 失重率指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 從圖5 可以看出，隨貯藏期延長(zhǎng)荔枝失重率一直處于上升趨勢(shì)，表明荔枝中的水分、養(yǎng)分在持續(xù)遺失，其質(zhì)量愈來(lái)愈差，除以蒸餾水為對(duì)照組外，其它三組濃度處理的荔枝，前3 d 失重率基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，表明連翹精油能有效減緩荔枝失重率的增大。3 d 后的處理組和對(duì)照組的荔枝失重率均呈明顯上升趨勢(shì)，但對(duì)照組失重率明顯高于處理組，且處理組的連翹果實(shí)精油含量越高，其失重率越低。所以，連翹果實(shí)精油含量為2.0%的乙醇溶液對(duì)荔枝有較好的保水性，對(duì)保持荔枝品質(zhì)的效果較為明顯。

2.4.2 可溶性固形物含量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 從圖6可以看出，總體上隨貯藏期延長(zhǎng)可溶性固形物處于不斷下降的趨勢(shì)，表明荔枝的營(yíng)養(yǎng)成分在持續(xù)損失，作為荔枝大量成分的可溶性固形物糖類(lèi)物質(zhì)，會(huì)因呼吸作用的消耗而不斷降低。在第7 d時(shí)，2.0%精油溶液處理的荔枝可溶性固形物含量與初始值對(duì)比僅損失了1.9%，該組相比其它三組對(duì)可溶性固形物的保持效果更好。蒸餾水對(duì)照組對(duì)可溶性固形物的保持效果最差，與初始值對(duì)比損失了3.4%。所以，連翹果實(shí)精油含量2.0%的乙醇溶液能較好保持荔枝可溶性固形物含量，對(duì)保持荔枝品質(zhì)的保鮮效果較為明顯。

圖6 可溶性固形物含量指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

(1)萃取試驗(yàn)結(jié)果表明，影響超臨界CO2萃取連翹果實(shí)精油的因素順序?yàn)?萃取時(shí)間＞萃取壓力＞萃取溫度;正交試驗(yàn)取得的優(yōu)化工藝參數(shù)為:萃取時(shí)間90 min、萃取壓力23 MPa、萃取溫度52℃，在該條件下選擇60%的乙醇夾帶劑濃度獲得的連翹果實(shí)精油萃取率為0.58%。

(2)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，連翹果實(shí)精油對(duì)兩種試驗(yàn)菌的抑菌效果為:金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌，2.0%連翹果實(shí)精油對(duì)金黃色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑為15.6 mm，對(duì)大腸桿菌的最大抑菌圈直徑10.2 mm，即連翹精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌能力較強(qiáng)。

(3)荔枝貯藏試驗(yàn)表明，以失重率和可溶性固形物含量為指標(biāo)的保鮮效果為:含有2.0%連翹果實(shí)精油的乙醇溶液能夠有效降低失重率、較好保持可溶性固形物含量，可適當(dāng)延長(zhǎng)荔枝保藏時(shí)間。

3.2 討論

本文采用超臨界CO2萃取連翹果實(shí)精油，相比于水蒸氣蒸餾法、醇提法，具有溶解性能好、傳質(zhì)性能高、流動(dòng)性能強(qiáng)、提取效率較高、安全無(wú)污染等突出優(yōu)點(diǎn)。但該技術(shù)亦有一定局限，如對(duì)設(shè)備要求較高、操作難度較大、能量消耗過(guò)大等，使其在實(shí)際生產(chǎn)中受到限制。

本研究以連翹果實(shí)為對(duì)象的精油提取率低于文獻(xiàn)報(bào)道的以連翹種子為對(duì)象的精油提取率［5］，究其原因一是種子中連翹精油含量最高;二是10月份采摘連翹果實(shí)時(shí)，蒴果已發(fā)黃而開(kāi)裂，相當(dāng)一部分種子掉于樹(shù)下土壤，所采果實(shí)中種子所剩無(wú)幾［11］。

連翹果實(shí)揮發(fā)性精油是一種成分較為復(fù)雜的混合物，將連翹精油用于荔枝保鮮效果良好。鑒于時(shí)間、經(jīng)費(fèi)等的關(guān)系，本文未對(duì)連翹精油各組分做進(jìn)一步分離純化研究，未闡述其對(duì)新鮮果蔬防腐的保鮮機(jī)理，這些尚需在今后的相關(guān)研究中予以關(guān)注。