余坤　周永春

昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室云南省腫瘤醫(yī)院分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室云南省癌癥中心分子診斷中心/肺癌研究重點實驗室，云南昆明650118

[摘要]3D培養(yǎng)模型的引入是細胞培養(yǎng)技術的一個里程碑，隨著新型支架、基質的發(fā)明與應用及細胞成像和分析系統(tǒng)的日新月異，三維細胞培養(yǎng)可模擬體內微環(huán)境而獲得傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)所沒有的優(yōu)勢，已在基礎研究、干細胞及組織工程等領域嶄露頭角。本文通過回顧3D細胞培養(yǎng)在藥敏實驗、藥物篩選、藥物研發(fā)、臨床應用中的貢獻，從藥物效應、藥物代謝及藥物敏感性著手，枚舉3D細胞培養(yǎng)通過改變基因/蛋白質差異表達來進行藥物研發(fā)，并對其應用趨勢、潛在優(yōu)勢和不足作一綜述，為基礎研究和臨床應用提供理論依據(jù)。

[關鍵詞]3D細胞培養(yǎng)（TDCC）;藥物研發(fā);藥物效應;藥物代謝;藥物敏感性

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2019）03-36-04

新靶標的發(fā)現(xiàn)及發(fā)揮作用的分子與化合物的合成是藥物研發(fā)的基礎與重中之重，藥代動力學和毒性效應是它們的作用機制[1-2]。技術的進步和學科之間的交叉滲透，使藥物發(fā)現(xiàn)過程變得不那么繁瑣反而更加簡易。生物信息學的發(fā)展使得藥物在體內的代謝、作用及預后等方面可進行體外模擬，進而確定潛在的藥物靶點成為可能。應用生物信息學（結構建模）結合藥物化學和細胞培養(yǎng)進行的體外藥物檢測已成為初期藥物研發(fā)的主要方式，這種方法不僅有助于節(jié)省時間和成本，還有助于發(fā)現(xiàn)針對患者治療的正誤和有效與否。近年，對三維細胞培養(yǎng)（three-dimensional cell culture，TDCC）技術最新進展的報道層出不窮，主要描述了該模型中癌細胞生長的不同物理特性和信號調控，癌細胞對藥物的敏感性和如何使藥物滲透至細胞，還報道了細胞對抗癌藥物的敏感性受到基質性質和使用的細胞類型的影響[3-5]。業(yè)已證明，TDCC模型結合微陣列和生物信息學對于藥物發(fā)現(xiàn)和篩選具有潛在的應用前景[6-8]。

1 TDCC誘導的基因表達和藥物效應

候選藥物在靶細胞中誘導的損傷程度是藥物研發(fā)的價值體現(xiàn)，而安全性檢測為副作用的發(fā)現(xiàn)提供了可能，是藥物篩選的基礎。與單層細胞培養(yǎng)相比，TDCC會誘導細胞基因和蛋白的差異表達，對識別新的藥物靶標更具實際意義[9]。

Li等[10]對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y進行了3D細胞培養(yǎng)，使用微陣列和RT-PCR分析了1766個基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)不同基質特性誘導的TDCC可發(fā)生特征性變化，并強調了該研究可直接應用于藥物劑量、代謝途徑、藥效等的檢測，為個體化精準醫(yī)療提供最佳治療結果。另一項關于TDCC誘導的基因表達差異的綜合研究是使用了對血管平滑肌細胞的9600個基因的微陣列分析。顯示在3D培養(yǎng)物（也稱為球體）中超過77種與藥物重新定位的相關基因發(fā)生過表達。Peyton團隊[12]將TDCC技術引入平滑肌細胞的培養(yǎng)，結果顯示TDCC中細胞外基質的力學特性可調節(jié)RhoA表達和活化，對細胞增殖具有顯著影響，有助于改善抗增殖藥物的使用。

Wang等[13]使用膠原蛋白作為TDCC生長基質培養(yǎng)嗅鞘細胞（OECs）已顯示獲得與體內細胞相似的包括形態(tài)學、凋亡、增殖等在內與自然微環(huán)境生存相關的若干特性。Debeb團隊的研究[14]表明應用TDCC技術培養(yǎng)的人類胚胎腎細胞（293T細胞）可用于提高藥物測試的效用，對藥物靶向具有啟示意義，包括基因TA1，RhoC，N-鈣黏素（N-cathedrin），vimentin，Notch1，β-catenin，zeb1，slug和snail都存在過表達，有望成為新的藥物靶標。無獨有偶，將人惡性膠質瘤細胞作為3D培養(yǎng)物生長時，具有DNA修復作用的O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）顯示出差異表達，3D較2D培養(yǎng)更能充分證明MGMT和GST表達不能預測成膠質細胞瘤細胞對烷化劑的敏感性，而烷基化劑與GST抑制劑的組合揭示了加和效應，進一步提出了在膠質母細胞瘤治療中應考慮抑制GST以獲得更好的有效性[15]。人卵巢癌細胞SKOV3在微流體芯片上作為3D工程組織培養(yǎng)時，具有上皮-間質轉化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）能力，這些細胞獲得了間充質成纖維細胞的形態(tài)，表達了纖連蛋白和N-cadherin的下調，具有低氧特性，并表達了上皮腫瘤標志物波形蛋白和CD362/EpCAM，這些不同的表達可用于探究靶向細胞凋亡和轉移的藥物[16]。Ghosh團隊通過寡核苷酸微陣列分析在多甲基丙烯酸甲酯包被的平板上生長為多細胞球狀體的黑色素瘤細胞，發(fā)現(xiàn)超過20，000個基因的表達，包括IL-8、CXCL1、CXCL2、CXCL3、ICCL20和ANG等基因顯著過表達，而CD49d和FGF基因的表達減少，這些結果提示研發(fā)腫瘤轉移、血管生成和癌癥進展的靶向藥物成為可能[17]。Debnath和Brugge的研究[18]為形態(tài)建模提供了管腔形成、細胞極性和細胞侵入等性質的重要特征，有助于發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)中基質金屬蛋白酶（MMP）的過表達和受體酪氨酸激酶（RTKs）、集落刺激因子1（CSF1）、表皮生長因子受體（EGFR）的功能以及導致EMT的途徑及其與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關的機制，為將3D細胞培養(yǎng)用于更現(xiàn)實相關的藥物研發(fā)是有利的提供有力的理論依據(jù)。這項研究還確定了新的分子在腫瘤進展中的作用，從而提出精準治療的潛在靶標。

2 高新技術助力3D培養(yǎng)和藥物代謝

TDCC技術能更加切合體內實際地了解藥物在體外的代謝。早在1994年，Boxberger團隊[19]就表明，當使用藻酸鹽對人類膀胱癌細胞RT112進行3D多細胞球體培養(yǎng)時，能夠形成良好的內質網和高爾基體，從而增強細胞發(fā)育、功能反應以及體外代謝活動。Lan等[20]研究組采用藻酸鹽構建三維支架，測定單層和3D培養(yǎng)物中包封細胞的I期/II期細胞活力和代謝特征，使用掃描電子顯微鏡（SEM）和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）評估了用肝癌細胞HepG2包裹的超無菌藻酸鹽水凝膠在高通量藥物篩選中的應用。結果 包裹細胞的增殖速率保持穩(wěn)定，14天后仍具有>80%的高細胞活力，并產生CYP1A1和CYP3A4肝特異性酶，表明細胞的存活力和功能性良好，且能持續(xù)保持II期細胞的谷胱甘肽活性。Labonia團隊[21]用3D打印流體裝置新型體外平臺來評估藥物的滲透和代謝。其允許三維細胞培養(yǎng)物進行動態(tài)給藥，用MALDI成像質譜法（IMS）檢查化療藥物伊立替康對結腸癌HCT116球狀體的滲透。還檢測到伊立替康的活性代謝物SN-38經24小時的治療后，被濃縮到球狀體細胞分裂活躍區(qū)（即外圍），表明這種獨特的體外平臺是評估3D細胞培養(yǎng)物中藥物滲透和代謝的有效手段。由于其成本效益和高通量，該創(chuàng)新系統(tǒng)可對候選藥物的臨床前評估產生重大轉變性影響。Feng等[22]利用聚己內酯（PCL）和羥基磷灰石（HAp）制成具有生物相容性，且平均孔徑167μm的近場靜電紡絲（NFES）復合支架，有效提高細胞的增殖和分化，并可根據(jù)PCL與HAp的比例控制降解速率，有效解決了3D系統(tǒng)不易分離細胞的缺陷。Choi團隊[23]研究發(fā)現(xiàn)TDCC技術培養(yǎng)的肝細胞樣細胞（HLCs）藥物代謝酶和肝轉運蛋白的基因表達顯著高于在2D培養(yǎng)的HLCs。此外，3D培養(yǎng)的細胞顯現(xiàn)特異性功能，包括白蛋白分泌和膽小管形成增加。特別地，3D球形培養(yǎng)物增加了編碼肝酯酶的CES1和BCHE的表達。通過膽堿酯酶活性測定得知HLC對奧司他韋的易感性增加，證實了這些肝酯酶的活性增強。多項研究證實，3D球形培養(yǎng)可增強細胞的成熟和藥物代謝，有助于優(yōu)化藥物篩選及毒性檢測。

3 改變藥物對3D細胞培養(yǎng)的敏感性

TDCC技術給藥效研究領域帶來了福音。它的出現(xiàn)已經極大地改變了藥物誘導的細胞毒性，基因毒性，抗增殖和類似作用的典型“劑量反應”的觀點。Castillo等[24]利用TDCC對60個肺癌細胞球狀體進行Gefitinib的敏感性探究，發(fā)現(xiàn)EGFR與hedgehog信號通路的G蛋白偶聯(lián)受體SMO是其敏感性相關的基因，并證實了吉非替尼與SMO抑制劑Cyclopamine和GDC0449具有潛在的協(xié)同作用。3D細胞培養(yǎng)物用于直接測試不同終點或化合物對藥物誘導的調節(jié)效應，大多數(shù)都針對不同終點的藥物測試，具有顯著基因表達變化，且可用于藥物發(fā)現(xiàn)的3D細胞培養(yǎng)研究枚舉于表1[25-28]。

4 結論

細胞培養(yǎng)是藥物研發(fā)、干細胞和腫瘤研究領域不可或缺的實驗對象。三維細胞培養(yǎng)已成為藥物研發(fā)的寶貴工具，為細胞的體外藥物研發(fā)模擬體內微環(huán)境，較2D培養(yǎng)更接近體內真實情況，有助于彌合體外和體內系統(tǒng)之間的差距，并可減少在早期發(fā)現(xiàn)階段使用動物的實驗次數(shù)，以減少藥效等方面的誤差。在諸如“組學”工具，納米技術和生物打印等高新領域的進步與融合，勢必增強3D細胞培養(yǎng)在藥物研發(fā)中的實用性。近年來，研究者們已經探索了自動化，微流體、芯片及NASA研發(fā)改進的微重力旋轉三維培養(yǎng)體系，盡管顯現(xiàn)出較2D培養(yǎng)的優(yōu)越性，然而，大多數(shù)3D培養(yǎng)物利用凝膠基質，但由于其固體和不透明性以及細胞暴露于外源信號的不一致性而限制了應用。在沒有凝膠基質的3D培養(yǎng)中，細胞傾向于彼此粘附并在中心形成具有壞死區(qū)的團塊，使得它們不易于分析，因此，TDCC在納入藥物研發(fā)、個體化精準診療等領域的共識及標準前，還有很多荊棘與坎坷亟待攻關和解決。

[參考文獻]

[1] Sanoh S，Ohta S.Contribution of chimeric mice with a humanized liver to the evaluation of pharmacology，toxicity and pharmacokinetics in drug discovery and development[J].Folia Pharmacologica Japonica，2018，151（5）：213-220.

[2] Ahlqvist M，Bo L，Hayes M A，et al.Early human in vivo pharmacokinetic predictions in drug discovery[J].Drug Metabolism&Pharmacokinetics，2018，33（1）：S43.

[3] Rijal G，Li W.3D Scaolds in breast cancer research[J]. Biomaterials，2016，37（81）：135-156

[4] Hoarau-Ve?chot J，Rafii A，Touboul C，et al.Halfway between 2D and Animal Models：Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions？[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（1）：181.

[5] Lv D，Hu Z，Lu L，et al.Three-dimensional cell culture： A powerful tool in tumor research and drug discovery （Review）[J].Oncology Letters，2017，36（14）： 6999-7010.

[6] Meli L，Jordan E T，Clark D S，et al.Influence of a Three- Dimensional，Microarray Environment on Human Cell Culture in Drug Screening Systems[J].Biomaterials，2012，33（35）：9087-9096.

[7] Florczyk S J，Simon M，Juba D，et al.A Bioinformatics 3D Cellular Morphotyping Strategy for Assessing Biomaterial Scaffold Niches[J].Acs Biomaterials Science&Engineering，2017，3（10）：2302-2313.

[8] Zhang B，Li Y，Wang G，et al.Fabrication of agarose concave petridish for 3D-culture microarray method for spheroids formation of hepatic cells[J].Journal of Materials Science Materials in Medicine，2018，29（5）：49.

[9] Soares C P，Midlej V，Benchimol M，et al.2D and 3D- organized cardiac cells shows differences in cellular morphology，adhesion junctions，presence of myofibrils and protein expression[J].Plos One，2012，7（5）：65.

[10] Li G N，Livi L L，Gourd C M，et al.Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices[J].Tissue Engineering Part A，2007，13（5）：1035-1047.

[11] Li S，Lao J，Chen BP，et al.Genomic analysis of smooth muscle cells in 3-dimensional collagen matrix[J].Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2003，17（1）：97.

[12] Peyton S R，Kim P D，Ghajar C M，et al.The Effects of Matrix Stiffness and RhoA on the Phenotypic Plasticity of Smooth Muscle Cells in a 3-D Biosynthetic Hydrogel System[J].Biomaterials，2008，29（17）：2597.

[13] Wang B，Zhao Y，Lin H，et al.Phenotypical analysis of adult rat olfactory ensheathing cells on 3-D collagen scaffolds[J].Neuroscience Letters，2006，401（1–2）： 65-70.

[14] Debeb B G，Zhang X，Krishnamurthy S，et al. Characterizing cancer cells with cancer stem cell- like features in 293T human embryonic kidney cells[J]. Molecular Cancer，9，2010，9（1）：180.

[15] Juillerat-Jeanneret L，Bernasconi CC，Bricod C，et al.Heterogeneity of human glioblastoma：glutathione- S-transferase and methylguanine-methyltransferase.[J]. Cancer Investigation，2008，26（6）：597-609.

[16] ChingTe Kuo，ChiLing Chiang，Ruby YunJu Huang，et al.Configurable 2D and 3D spheroid tissue cultures on bioengineered surfaces with acquisition of epithelial|[ndash]|mesenchymal transition characteristics[J].Npg Asia Material，2012，50（4）：27.

[17] Ghosh S，Spagnoli G C，Martin I，et al. Three‐dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile：A high density oligonucleotide array study[J].Journal of Cellular Physiology，2005，204（2）：522-531.

[18] Debnath J，Brugge J S.Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures[J].Nature Reviews Cancer，2005，5（9）：675-88.

[19] Boxberger H J，Meyer T F.A new method for the 3‐D in vitro growth of human RT112bladder carcinoma cells using the alginate culture technique[J].Biology of the Cell，

1994，82（2-3）：109-119.

[20] Lan S F，Safiejko-Mroczka B，Starly B.Long-term cultivation of HepG2 liver cells encapsulated in alginate hydrogels：a study of cell viability，morphology and drug metabolism[J].Toxicology in Vitro，2010，24（4）： 1314-1323.

[21] Labonia G J，Lockwood S Y，Heller A A，et al.Drug penetration and metabolism in 3-dimensional cell cultures treated in a 3D printed fluidic device：Assessment of irinotecan via MALDI imaging mass spectrometry[J]. Proteomics，2016，16（11-12）：1814-1821.

[22] He F L，Li D W，He J，et al.A novel layer-structured scaffold with large pore sizes suitable for 3D cell culture prepared by near-field electrospinning.[J].Materials Science&Engineering C Materials for Biological Applications，2018，77（86）：18.

[23] Choi Y J，Kim H，Kim J W，et al.Hepatic esterase activity is increased in hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells using a 3D culture system[J]. Biotechnology Letters，2018，40（2）：1-9.

[24] Castillo G，Jiang X.Abstract 5447：Association of the hedgehog signal pathway to Gefitinib sensitivity in a 3D cancer cell lines screening[J].Cancer Research，2015，75（12）：5852-5862.

[25] Shoemaker J T，Vukasinovic J.Abstract 4080：Cytochrome P450 enzyme activity is enhanced in hepatocytes grown using a perfused 3D cell culture drug screening system[J]. Cancer Research，2017，77（13）：4080.

[26] Abefukasawa N，Otsuka K，Aihara A，et al.Novel 3D Liquid Cell Culture Method for Anchorage-independent Cell Growth，Cell Imaging and Automated Drug Screening[J].Scientific Reports，2018，8（1）：3627.

[27] Souza A G，Silva I，Camposfernandez E，et al.Comparative Assay of 2D and 3D Cell Culture Models：roliferation，Gene Expression and Anticancer Drug Response.[J]. Current Pharmaceutical Design，2018，24（9）：17-18.

[28] Han J，Oh S，Hoang HH，et al.Recapitulation of cancer stem cell niches in glioblastoma on 3D microfluidic cell culture devices under gravity-driven perfusion[J].Journal of Industrial & Engineering Chemistry，2018，100（62）：352-361.