張文泉，羅國濤，姚慶智

（1.凱里學院，貴州 凱里 556011；2.內蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

棉革菌屬Tomentella Pers.ex Pat 屬擔子菌門Basidiomycota 傘菌綱樹種及水青岡Fagus longipetiolata Seem，樺木Betula 等闊葉樹種形成外生Agaric-omycetes 革菌目Thelephorales 革菌科Thelephoraceae[1-2]，常與馬尾松Pinus massoniana Lamb，油松Pinus tabuliformis Carriere 等針葉菌根[3-4]，與杜鵑Rhododendron simsii Planch，蘭花Cymbidiumss 等草本或灌木形成內生菌根[5-7]。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，菌根扮演著非常重要的角色，對其穩(wěn)定性起著至關重要的作用，而對棉革菌屬真菌研究發(fā)現(xiàn)，幾乎棉革菌屬的所有種均能形成菌根，因此，在森林生態(tài)系統(tǒng)中，棉革菌的作用不容忽視，具有重要意義[8]。

由于棉革菌屬的子實體顏色以深色為主，多呈絮狀或蛛網(wǎng)狀平伏與腐木，枯枝或石頭，土洞上緊貼生長，難以發(fā)現(xiàn)，因此國內外對于棉革菌屬的研究多集中于棉革菌屬所形成的外生菌根上。國內對棉革菌屬的研究均為棉革菌屬外生菌根研究：謝雪丹等對云南松幼苗上6 種Tomentella 外生菌根真菌形態(tài)進行報道[9]，樊永軍等對在青海云杉外生菌根中發(fā)現(xiàn)Tomentella 菌根真菌[10]，王琴等對油松上的5 種Tomentella 外生菌根進行描述[11]，魏杰等在興安落葉松、白樺、沙地云杉、山楊和樟子松等內蒙古地區(qū)的主要樹種上都發(fā)現(xiàn)有Tomentella 外生菌根[12-13]，但對棉革菌形成的子實體鮮有報道。雖對棉革菌子實體的報道較少，但其分布極其廣泛，幾乎遍布全球[14-20]。

雷公山國家級自然保護區(qū)位于貴州省黔東南州中部，屬于中亞熱帶季風山地濕潤區(qū)，為貴州省苗嶺山脈東段主峰，雷公山最高峰海拔為2 178.8 m，跨 度為108°5′～108°24′E，26°15′～ 26°32′N，總面積 47 792 hm2，年平均氣溫為14.3 ℃，年降水量 1 300～1 600 mm，具有夏無酷暑、冬無嚴寒、雨量充沛的氣候特點，光、熱、水資源豐富，氣候類型多樣，蘊藏著豐富的生物資源，其中高等植物278 科2 582 種，列為國家重點保護的有紅豆杉、南方紅豆杉、異形玉葉金花，伯樂樹、禿杉、十齒花等32 種。雷公山已知的大型真菌有50 科263 種其中白蘑科、紅菇科、側耳科和多孔菌科的種類及數(shù)量占優(yōu)勢，占已知總數(shù)的47%，但未見棉革菌子實體的報道。

本研究從雷公山自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)的棉革菌子實體入手，通過對其進行分類鑒定，并結合分子鑒定，首次對雷公山國家級自然保護區(qū)的棉革菌子實體進行報道。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2016年 6—8月在雷公山國家級自然保護區(qū)的不同林分中采集樣品，記錄所采集到新鮮子實體的宏觀形態(tài)，在常綠闊葉林（以栲樹Castanopsis fargesii Franch.、青岡Quercus glauca Thunb.為優(yōu)勢樹種）中采集子實體樣本6 份，在落葉闊葉林（以亮葉樺Betula luminifera H.Winkl.、響葉揚Populus Adenopoda Maxim.為優(yōu)勢樹種）中采集子實體樣本11 份，在針葉林（以馬尾松Pinus massoniana Lamb 為優(yōu)勢樹種）中采集子實體樣本9 份，在灌木從（以白櫟Quercus fabri Hance 及麻櫟Quercus acutissima Carruth.為優(yōu)勢種）中采集子實體樣本3份，共計采集得子實體樣本29 份。

1.2 實驗方法

1.2.1 子實體樣品的處理

將樣品帶回實驗室及早加熱干燥后存于錫箔紙制成的密封袋中并編號。干燥后的標本將用于解剖描述和分子鑒定。

1.2.2 子實體微觀形態(tài)觀察

在載玻片上分別滴2.5%的KOH 和蒸餾水，將子實體要觀察的部位于解剖鏡下刮下，放置于載玻片上的溶液中，蓋上蓋玻片，采用光學顯微鏡觀察，對子實層中根狀菌索、Subicular 菌絲、Subhymenial 菌絲、囊狀體、擔子及擔孢子，的特征觀察、照相，再進行描述及測量。子實體擔孢子以及根狀菌索等結構的形態(tài)使用掃描電子顯微鏡觀察、照相，再進行描述及測量。

1.2.3 子實體樣品的分子鑒定

1.2.3.1 DNA 的提取

子實體樣品基因組DNA 的提取，采用試劑盒提取，采用的試劑盒為TaKaRa MiniBEST 植物基因組DNA 提取試劑盒。

1.2.3.2 PCR 擴增

PCR 反應體系為25 μL，其中加入DNA 模板2 μL，引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) 0.5 μL，引 物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC) 0.5 μL，dNTP-Mix2 μL，Easy Taq buffer 2.5 μL，Taq-Polymerase 0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35 個循環(huán)，72 ℃平展5 min。

1.2.3.3 測序

將擴增所得產(chǎn)物測序，測序由金斯瑞生物科技公司完成。測序后所得的序列采用Bioedit 編輯，在NCBI 中進行BLAST 序列比對。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

運用貝葉斯法對子實體樣品中所獲得的ITS 區(qū)段的堿基序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 不同類型子實體形態(tài)特征描述

通過對子實體的宏觀及微觀形態(tài)特征進行觀察分析，將初步確定為棉革菌的子實體樣本分為7種類型，分別描述如下：

1）T.sp1 形態(tài)特征描述

T.sp1 子實體呈平伏狀，緊貼于水青岡的腐木表面生長。子實層顏色為棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為深棕色。根狀菌索較大，顏色為淺棕色，單型（圖1A、F），菌絲緊密纏繞而且具鎖狀聯(lián)合，很少出現(xiàn)單隔，直徑為3.0～4.3 μm。Subicular 菌絲稍彎曲（圖1B），末端具有螺紋結構（圖1G），顏色為棕色，具鎖狀聯(lián)合，無被殼，直徑為3.3～4.7 μm。Subhymenial 菌絲彎曲，無短小膨大（圖1C），顏色為淺棕色，具鎖狀聯(lián)合，直徑3.5～5.8 μm。無囊狀體。擔子形狀為棒狀，具有4 個小梗，不具柄，稍彎曲，顏色為淺棕色，基部具有鎖狀聯(lián)合，無橫隔，無油滴（圖1D、H）。長20～28 μm。孢子形狀正面觀球形，側面觀橢球形，具較密集刺狀紋飾，顏色為淺棕色。無油滴（圖1E、I），正面觀直徑5.1～8.3 μm，側面觀直徑5.1～8.2 μm，無厚垣孢子。

T.sp1 子實體樣本采集于常綠闊葉林中。

圖1 T.sp1 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.1 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp1

2）T.sp2 形態(tài)特征描述

T.sp2 子實體呈平伏狀，緊貼于亮葉樺的腐木表面生長。子實層顏色為黑棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為深棕色，無根狀菌索。Subicular 菌絲有短小的側枝（圖2A），顏色為深棕色，具鎖狀聯(lián)合，少有單隔，無被殼，淺棕色，直徑為4.5～7.1 μm。Subhymenial 菌絲無短小膨大（圖2B），顏色為深棕色，具鎖狀聯(lián)合，無被殼，直徑4.7～6.7 μm。無囊狀體。擔子形狀較彎曲，為瓶狀，顏色為深棕色，具有4 個小梗，不具柄，擔子的基部具鎖狀聯(lián)合，偶爾具橫隔（圖2C、D），長24～36 μm 孢子正面觀球形，倒三角形，側面觀橢球形，具有多分叉而且分離的刺狀紋飾，無油滴（圖2E、F），正面觀直徑6.3～8.8 μm，側面觀直徑6.4～8.1 μm，顏色為深棕色。無厚垣孢子。

T.sp2 子實體樣本采集于落葉闊葉林中。

3）T.sp3 形態(tài)特征描述

T.sp3 子實體呈平伏狀，緊貼于亮葉樺的腐木表面生長。子實層顏色為黃棕色，子實體表面為絨毛狀，菌絲層顏色為黃棕色。根狀菌索顏色為深棕色，具有單型，二型兩種，單型根狀菌索具鎖狀聯(lián)合，少具單隔，直徑1.7～3.1 μm。二型根狀菌索呈平行狀緊密纏繞較細的骨架菌絲，不具鎖狀聯(lián)合（圖3A）。Subicular 菌絲顏色為淺棕色，具鎖狀聯(lián)合，無被殼（圖3B），直徑為4.5～6.1 μm。Subhymenial 菌絲顏色為淺棕色，具鎖狀聯(lián)合，無被殼，無短小膨大（圖3C），直徑4.5～6.3 μm。無囊狀體。擔子形狀為棒狀，具有4 個小梗，小梗較長，具柄，稍彎曲，基部具鎖狀聯(lián)合，無橫隔，無油滴（圖3D），顏色為深黃色，長34～47 μm。孢子較大，正面觀，側面觀均為球形或橢球形，顏色為棕色（圖3E），具有較密集的刺狀紋飾（圖3F），正面觀直徑8.8～13.6 μm，側面觀直徑8.3～10.0 μm。無厚垣孢子。

圖3 T.sp3 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.3 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp3

T.sp3 子實體樣本采集于落葉闊葉林中。

4）T.sp4 形態(tài)特征描述

T.sp4 子實體呈平伏狀，緊貼于響葉楊的腐木表面生長，子實層顏色為棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為棕色。根狀菌索類型為單型，顏色為深棕色，具鎖狀聯(lián)合（圖4A），菌絲緊密纏繞。Subicular 菌絲有時具有被殼，顏色為棕色，具鎖狀聯(lián)合（圖4B、C）直徑為3.8～5.4 μm。無囊狀體。擔子形狀較彎曲，為棒狀顏色為棕色，具柄，具有4 個小梗，擔子的基部具有鎖狀聯(lián)合（圖4D），長27～33 μm。孢子正面觀，側面觀均為球形至橢球形，具有密集且較短刺狀紋飾，顏色為淺棕色，無油滴，（圖4E、F），正面觀直徑5.5～7.5 μm，側面觀直徑5.5～7.3 μm。無厚垣孢子。

T.sp4 該子實體樣本采集于落葉闊葉林中。

圖4 T.sp4 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.4 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp4

圖5 T.sp5 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.5 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp5

5）T.sp5 形態(tài)特征描述

T.sp5 子實體呈平伏狀，緊貼于馬尾松的腐木表面生長，子實體表面有蛛網(wǎng)膜，子實層顏色為黃棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為黑褐色。根狀菌索類型為單型，具單隔，纏繞較松散，顏色為深棕色（圖5A），菌絲直徑為3.1～4.2 μm。Subicular 菌絲有時具被殼，具單隔，偶有鎖狀聯(lián)合（圖5B），顏色為棕色，直徑3.5～5.4 μm。囊狀體在菌絲中出現(xiàn)，形狀為棒狀，偶有被殼，具橫隔（圖5C）顏色為淺棕色，長47.1～83.8 μm。擔子形狀為棒狀，不具柄，具有四個小梗，較彎曲，具鎖狀聯(lián)合，偶有橫隔出現(xiàn)，具油滴，常無色（圖5D），長2 435 μm。孢子正面觀球形，側面觀橢球形，具密集、較短、多分叉刺狀紋飾，無油滴，顏色為深黃色（圖5E、F），正面觀直徑5.0～7.1 μm，側面直徑5.3～6.7 μm，無厚垣孢子。

T.sp5 子實體樣本采集于針葉林中。

6）T.sp6 形態(tài)特征描述

T.sp6 子實體呈平伏狀，緊貼于馬尾松的腐木表面生長。子實層顏色為深棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為深棕色。無根狀菌索。Subicular 菌絲具被殼，少見單隔，具鎖狀聯(lián)合，顏色為棕色（圖6A、E），直徑為5.0～7.2 μm。Subhymenial菌絲具被殼。無短小膨大，具鎖狀聯(lián)合，顏色為深棕色（圖6B），直徑為5.2～7.4 μm。無囊狀體。擔子長形狀為瓶狀，不具柄，有四個小梗，較彎曲，具鎖狀聯(lián)合，偶有橫隔，無油滴，顏色為棕色（圖6C），長為28～32 μm。孢子正面觀，側面觀均為球形至橢球形，具密集的刺狀紋飾，無油滴，顏色為棕色（圖6D、F），正面觀直徑6.3～8.1 μm，側面直徑6.1～7.7 μm，無厚垣孢子。

T.sp6 子實體樣本采集于針葉林中。

7）T.sp7 形態(tài)特征描述

T.sp7 子實體呈平伏狀緊貼于麻櫟灌木層根部的腐木上生長，子實層顏色為棕色，子實層表面為顆粒狀，菌絲層顏色為棕色。根狀菌索較大，單型，具被殼，具鎖狀聯(lián)合，菌絲松散纏繞，顏色為深棕色（圖7A），中央菌絲較粗，直徑為4.3～8.5 μm，外圍菌絲較細，1.1～2.8 μm。Subicular 菌絲具被殼，具鎖狀聯(lián)合，（圖7B、F），顏色為深棕色，直徑為5.0～7.3 μm。Subhymenial菌絲偶有被殼，具鎖狀聯(lián)合，偶有短小，但無膨大（圖7C）。顏色為淺棕色，直徑4.1～6.3 μm。無囊狀體。孢子正面觀，側面觀均為球形至橢球形，具較密集刺狀紋飾，無油滴，顏色為棕色直徑6.5～8.2 μm，側面直徑7.1～8.3 μm，（圖7E），無厚垣孢子。

圖6 T.sp6 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.6 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp6

圖7 T.sp7 宏觀及微觀形態(tài)解剖結構圖Fig.7 Macroscopic and microcosmic anatomical characteristics of T.sp7

T.sp7 子實體樣本采集灌木從中。

綜合上述子實體宏觀及微觀形態(tài)特征分析可知：上述所采集的7 種類型的子實體可初步判定屬于棉革菌。對其總結得出：雷公山國家級自然保護區(qū)所采集的7 種類型的棉革菌子實體的子實層顏色與菌絲層顏色基本一致，均接近棕色，7 種類型的子實層表面形狀有6 種為顆粒狀，只有1種為絨毛狀。7 種類型的棉革菌子實體中的5 種類型具有根狀菌索，根狀菌索大部分為單型，其中一種類型的根狀菌索具有單型、二型兩種，均具鎖狀聯(lián)合或具單隔，表面有菌絲纏繞。7 種類型的棉革菌子實體的Subicular 菌絲，Subhymenial 菌絲均具單隔或具鎖狀聯(lián)合，較彎曲，較短小，顏色均靠近棕色。僅有一種類型出現(xiàn)囊狀體。7 種類型的棉革菌子實體的擔子顏色均與棕色相似，形狀以棒狀為主少數(shù)為瓶狀，均具鎖狀聯(lián)合或單隔，具柄，具橫隔，較彎曲。7 種類型的棉革菌子實體的孢子形狀多為球形或橢球形，紋飾類型為規(guī)則刺狀。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對雷公山國家級自然保護區(qū)所采集的樣品進行形態(tài)學分類后獲得的7 種類型的子實體分別用試劑盒提取DNA，對所獲得的DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物再進行測序，對所得序列進行BLAST 比對，對與其同源性較高的代表序列進行下載，以Th.pseudoterrestris 為外群，將所測序列編號并與下載序列一并建立貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。由圖8分析可知，7 種類型子實體樣品的序列均聚在了棉革菌Tomentella 屬真菌的序列中，由此可知：此7 種類型子實體都屬于棉革菌屬。T.sp7 形成一個獨立分支，沒有與其他棉革菌序列聚集，由此推測：T.sp7 可能為尚未報道的棉革菌新種。T.sp6聚于T.ramosissima（JX630859，來自美國）與T.lapida（KU525697，來自波蘭）形成的分支之間。T.sp5 與T.fuscocinerea（GU214810，來自愛沙尼亞）聚于一個分支上。T.sp4 和T.intsiae（NR121286，來自美國）聚在一起。T.sp3 與T.bryophila 相聚在一起。T.sp2 與T.stuposa（JQ888213，來自拉脫維亞）聚在一起。T.sp1 與T.galzinii（AM924141，來自俄羅斯）聚在一個分支上。說明其親緣關系可能較近。通過采用表型分析和rDNA-ITS 序列分析等首次對雷公山國家級自然保護區(qū)7 種類型的棉革菌子實體的形態(tài)特征進行詳細描述并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析得出該7種類型的子實體均屬于棉革菌屬。本研究采用傳統(tǒng)分類方法，依據(jù)子實體的形態(tài)特征將雷公山國家級自然保護區(qū)采集子實體大致分為7 種不同的類型，再對其進行分子鑒定，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。通過傳統(tǒng)的形態(tài)解剖特征鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析研究相結合對雷公山國家級自然保護區(qū)所采集的棉革菌子實體進行研究后得知：系統(tǒng)發(fā)育樹中部分子實體序列與數(shù)據(jù)庫中的棉革菌序列聚集在一起，但對于聚集在一起的兩種類型的形態(tài)解剖特征分析卻發(fā)現(xiàn)二者存在較大差異，難以一一對應。如在系統(tǒng)發(fā)育樹上與T.sp1 最為相近的是T.galizinii[15]，但通過形態(tài)解剖特征對比發(fā)現(xiàn)，T.galizinii 的最為典型的特征是末端具有形狀較尖的囊狀體，而T.sp1 無囊狀體；T.galizinii 無根狀菌索，而T.sp1 具有較大的根狀菌索；T.galizinii 的孢子多為掌狀或倒三角形狀，而T.sp1 的孢子多為球形或橢球形。出現(xiàn)此類現(xiàn)象，其原因有以下兩點：第一，本次研究所采集的棉革菌子實體均是呈平伏狀附著于腐木上，一般情況下難以發(fā)現(xiàn)，所采集的部分樣品出現(xiàn)缺失的狀況，導致對子實體標本的研究內容不夠全面，程度不夠深入；第二，基于數(shù)據(jù)庫中所收集的絕大多數(shù)棉革菌的基因序列均來自歐美地區(qū)，缺乏來自中國地區(qū)的棉革菌序列，堿基差異通常會比較大，以往對棉革菌的研究中，由于實驗條件的局限性，諸多研究均只對棉革菌屬的大型真菌的形態(tài)特征進行描述，并無分子鑒定，造成基因數(shù)據(jù)庫中相關棉革菌序列的缺乏，從而導致在后續(xù)的研究過程中進行序列比對時造成缺失，對系統(tǒng)發(fā)育分析造成了一定的困難，很多的子實體樣本只能定到屬的水平而不能定到種的水平。后續(xù)研究過程中應對棉革菌子實體的樣品采集范圍擴大，所得序列均上傳至數(shù)據(jù)庫中，多補充中國范圍內棉革菌序列，以期推動我國對棉革菌更深層次的研究。

圖8 基于rDNA-ITS 序列采用貝葉斯法構建所得的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree of samples generated from rDNAITSITS sequences by using MrBayes