辛曙麗 郭德勝 賴涵旸 劉永華

摘 ?要??以T4代的轉(zhuǎn)基因番茄為材料，研究細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶（CWIN）活性上調(diào)對(duì)番茄果實(shí)和種子發(fā)育的不同影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CWIN活性上調(diào)增加了單果鮮重，但單果種子數(shù)量、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率顯著下降，表明CWIN在促進(jìn)番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)，抑制了種子的生長(zhǎng)發(fā)育。進(jìn)一步的生理生化指標(biāo)測(cè)定表明，造成上述現(xiàn)象的可能原因有2個(gè)：①CWIN活性上調(diào)導(dǎo)致果實(shí)中儲(chǔ)存的淀粉含量下降，同時(shí)己糖（葡萄糖和果糖）含量顯著上升，表明轉(zhuǎn)基因果實(shí)利用過剩光合產(chǎn)物所積累的淀粉的能力增強(qiáng)，從而可以利用的糖分增加，但這些糖分主要被用于果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)己糖的積累，而不是用于種子生長(zhǎng)發(fā)育。②CWIN活性上調(diào)還導(dǎo)致果實(shí)中的葉綠素含量下降，推測(cè)這可能會(huì)導(dǎo)致果實(shí)的光合作用下降，從而造成種子生長(zhǎng)發(fā)育得不到充足的糖分供應(yīng)，因而生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制?？傊?，CWIN活性上調(diào)可抑制種子發(fā)育和促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，這將為進(jìn)一步提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)提供一種新的思路和方法。

關(guān)鍵詞 ?番茄;細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶;蔗糖代謝;果實(shí);種子中圖分類號(hào)??S641.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Differential?Effects of Up-regulation of Cell Wall Invertase Activity on Fruit and Seed Development in Tomato

XIN Shuli²， GUO Desheng¹， LAI Hanyang¹， LIU Yonghua^1*

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Administration?Bureau of Agricultural Technology?of Lingshui， Lingshui， Hainan 572400， China

Abstract ?The T4 transgenic tomato with elevated CWIN activity was employed to study the effects of CWIN on seed and fruit development. It was found that the elevated CWIN activity resulted in increased?fresh weight per fruit， but decreased seed number per fruit， seed germination rate and germinability. These results showed that although the development?of fruit was enhanced by the elevated CWIN activity， the development of seed was impaired. Further investigations at physiological level revealed two possible reasons for the above-stated phenomenon： ①The elevation of CWIN activity led to decreased starch content and increased?hexose （i.e. glucose and fructose） content， indicating there was enhanced capability of transgenic fruits in utilizing photo-assimilates， which facilitating the development of fruit and the hexose accumulation in fruit， instead?of the development of seed. ②The elevation of CWIN activity also resulted in decreased content of chlorophyll in fruits， implying decreased photosynthetic activity of fruit and thus inhibiting seed development due to inadequate supply of photo-assimilates to seed from fruit photosynthesis. Altogether， the elevation of CWIN activity inhibited the development of seed， but promoted that of fruit， which could provide a new pathway to increase the yield and quality of tomato.

Keywords ?tomato; cell wall invertase; sucrose metabolism; fruit; seed

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.009

蔗糖分解代謝在種子和果實(shí)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，是決定種子和果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì)的重要因素^[1-2]。蔗糖及其分解產(chǎn)生的己糖（葡萄糖和果糖）不僅為果實(shí)和種子的發(fā)育提供碳骨架和能量，而且也作為信號(hào)分子通過調(diào)控不同基因的表達(dá)從而影響果實(shí)和種子的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。

植物體內(nèi)有2種分解蔗糖的酶：蔗糖合成酶（sucrose synthase，Sus）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（sucrose invertase，INV）。其中Sus將蔗糖分解為UDP-葡萄糖和果糖，而INV將蔗糖水解為葡萄糖和果糖^[3]。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，INV可進(jìn)一步劃分為3類：細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（cell wall invertase，CWIN）、液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar invertase，VIN）和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（cytoplasmic invertase，CIN）^[4]。研究表明，CWIN是影響種子和果實(shí)發(fā)育的重要蔗糖分解酶之一。例如，玉米胚乳中CWIN基因的突變導(dǎo)致其活性下降以后，胚乳中的細(xì)胞分裂和膨大受到抑制，表現(xiàn)為種子皺縮變小^[5-6]。水稻中的CWIN基因GIF1是控制種子灌漿過程的關(guān)鍵基因，GIF1的突變導(dǎo)致種子變小、堊白增加，產(chǎn)量和品質(zhì)均出現(xiàn)下降^[7]。通過RNA干擾技術(shù)抑制番茄果實(shí)中主要CWIN基因Lin5的表達(dá)導(dǎo)致落花落果率增加，果實(shí)產(chǎn)量下降^[8]。CWIN抑制因子是一種小分子蛋白質(zhì)，可以和CWIN蛋白結(jié)合從而降低CWIN的活性。通過減少CWIN抑制因子表達(dá)的方式來增加CWIN的活性則可增加番茄在熱脅迫下的座果率和產(chǎn)量^[9]。然而，前人的研究?jī)H僅孤立地關(guān)注CWIN活性變化對(duì)果實(shí)或種子生長(zhǎng)發(fā)育的影響，很少同時(shí)關(guān)注果實(shí)和種子的生長(zhǎng)發(fā)育，特別是兩者的均衡發(fā)育和相互影響的問題。

果實(shí)和種子的發(fā)育之間存在著復(fù)雜的相互作用。一方面，種子可提供果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育所需的激素，而果實(shí)將種子包裹起來，為其種子生長(zhǎng)發(fā)育提供保護(hù)和養(yǎng)分^[10]。另一方面，在果實(shí)和種子這2個(gè)器官之間還存在顯著的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。例如，對(duì)菜豆豆莢發(fā)育的研究表明，在豆莢發(fā)育初期，莢壁（果實(shí)）與種子對(duì)蔗糖的吸收利用存在顯著的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，只是到了豆莢發(fā)育的后期，莢壁中的養(yǎng)分才重新進(jìn)行分配進(jìn)入種子，促進(jìn)種子的生長(zhǎng)^[11]。在羽扇豆莢壁和種子的發(fā)育中也觀察到類似的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)35個(gè)羽扇豆品種的研究表明，莢壁在豆莢中所占的比重越大，則最終種子的產(chǎn)量越低，即莢壁和種子生長(zhǎng)量之間呈顯著負(fù)相關(guān)^[12]。因此，在全球糧食產(chǎn)量增長(zhǎng)已達(dá)到平臺(tái)期很難進(jìn)一步提升的大背景下，對(duì)種子或果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行有目的的調(diào)控有望進(jìn)一步提高全球糧食產(chǎn)量。

本研究以番茄為模式植物，通過RNA干擾技術(shù)（RNAi）降低CWIN抑制因子的表達(dá)來提高CWIN的活性，然后研究其對(duì)番茄果實(shí)和種子生長(zhǎng)發(fā)育的不同影響及其相關(guān)作用機(jī)理，從而為進(jìn)一步提高糧食產(chǎn)量提供新的思路和理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)材料為新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所育成的番茄品種‘新番2號(hào)，Jin等^[13]利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)該番茄中CWIN抑制因子的表達(dá)，從而提高了植株中的CWIN活性。2017年3月28日將T4代轉(zhuǎn)基因種子播種于?？谑泻Ｄ洗髮W(xué)實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi)。5月10日定植于栽培盆內(nèi)（盆高35?cm，上口徑29?cm），每盆1株番茄，野生型和轉(zhuǎn)基因植株各8盆。盆中的基質(zhì)配比為土∶椰糠∶腐熟羊糞=1∶1∶2，并混合適量復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）。6月8號(hào)開始進(jìn)行開花掛牌，以記錄和確認(rèn)每個(gè)果實(shí)的發(fā)育時(shí)期。

1.2 方法

1.2.1 ?番茄果實(shí)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定??‘新番2號(hào)屬于有限生長(zhǎng)型的早熟番茄品種，植株在結(jié)3串果后封頂，果實(shí)在花后40?d左右基本達(dá)到成熟期。記錄每株番茄成熟果實(shí)的單果鮮重和單株果實(shí)鮮重。

1.2.2 ?番茄種子相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定??番茄果實(shí)達(dá)到紅熟期后進(jìn)行采摘，經(jīng)過7?d后熟后將種子從果實(shí)中取出、洗凈并晾干，分別測(cè)定單個(gè)果實(shí)中種子的數(shù)量、種子千粒重。

種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的測(cè)定：將單株番茄上的種子混合，隨機(jī)選取100粒種子進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。首先將種子在70%酒精中浸泡、振蕩1?min，然后在稀釋40倍的8%次氯酸鈉溶液中浸泡5?min。把消過毒的種子放于培養(yǎng)皿中，在恒溫28?℃的條件下進(jìn)行催芽，記錄第3天發(fā)芽的種子數(shù)并計(jì)算其發(fā)芽勢(shì)，以第7天的發(fā)芽數(shù)計(jì)算其最終的發(fā)芽率。

1.2.3 ?番茄果實(shí)中CWIN活性、可溶性糖和淀粉含量的測(cè)定??本研究取花后25 d的果實(shí)用于CWIN活性的測(cè)定，具體參照Tomlinson等^[14]的方法。取花后10、25和40 d的番茄果實(shí)進(jìn)行CWIN酶可溶性糖和淀粉含量的測(cè)定（均以鮮重計(jì)）。蔗糖、葡萄糖、果糖含量測(cè)定參照King等^[15]的酶學(xué)方法。淀粉含量的測(cè)定參考Smith等^[16]的酶學(xué)測(cè)定方法。

1.2.4 ?葉綠素含量的測(cè)定??參考李蒙等^[17]的方法，采用乙醇、丙酮、水混合液浸提葉綠素，然后利用分光光度計(jì)測(cè)定花后25 d番茄果實(shí)中的葉綠素含量，以鮮重計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t-test分析。

2??結(jié)果與分析

2.1 CWIN活性上調(diào)對(duì)果實(shí)數(shù)量和大小的影響

果實(shí)的數(shù)量和大小共同決定番茄的最終產(chǎn)量，因此首先測(cè)定了CWIN活性上調(diào)對(duì)番茄花后40 d果實(shí)數(shù)量和大小的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄（RNAi）和野生型番茄（WT）雖然在單株果實(shí)數(shù)量上沒有顯著差異（圖1A），但轉(zhuǎn)基因番茄單個(gè)果實(shí)的鮮重顯著高于野生型番茄（圖1B）?；ê?5 d果實(shí)中CWIN活性的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因果實(shí)的CWIN活性顯著高于野生型果實(shí)（圖1C）。上述證據(jù)表明，CWIN活性的上調(diào)促進(jìn)了番茄果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.2 CWIN活性上調(diào)對(duì)番茄果實(shí)可溶性糖和淀粉含量的影響

本研究所采用的番茄‘新番2號(hào)屬于早熟品種，果實(shí)在花后40?d已達(dá)到紅熟期。花后10、25和40 d果實(shí)可溶性糖的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因（RNAi）果實(shí)的葡萄糖和果糖含量顯著高于野生型（WT），但兩者在蔗糖含量方面沒有顯著差異（圖2A～圖2C）。此外，果實(shí)中的葡萄糖和果糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蔗糖含量。

淀粉含量的測(cè)定結(jié)果表明，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因和野生型果實(shí)中的淀粉含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖2D）。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因番茄的淀粉含量在各個(gè)發(fā)育時(shí)期始終顯著高于野生型番茄。

2.3 CWIN活性上調(diào)對(duì)番茄種子生長(zhǎng)發(fā)育的影響

上述結(jié)果表明，CWIN活性上調(diào)增加了單果鮮重。由于果實(shí)和種子的生長(zhǎng)發(fā)育之間存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此對(duì)番茄種子的生長(zhǎng)發(fā)育也進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然轉(zhuǎn)基因番茄種子的千粒重沒有發(fā)生顯著變化（圖3A），但是轉(zhuǎn)基因番茄單個(gè)果實(shí)中的種子數(shù)量下降了32%，顯著低于野生型（圖3B）。種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，轉(zhuǎn)基因番茄種子的發(fā)芽率（發(fā)芽7 d后）顯著降低，僅為野生型的57%（圖3C）。此外，發(fā)芽勢(shì)（發(fā)芽3 d后）受到的影響更為明顯，轉(zhuǎn)基因番茄僅為野生型的46%（圖3D）。上述證據(jù)表明，CWIN活性上調(diào)不僅導(dǎo)致果實(shí)中種子的數(shù)量下降，同時(shí)種子質(zhì)量也顯著下降。

2.4?CWIN活性上調(diào)對(duì)果實(shí)葉綠素含量的影響

本研究所使用的T4代轉(zhuǎn)基因番茄植株和野生型植株在開花結(jié)果之前很難從外觀上進(jìn)行區(qū)分，但開花結(jié)果后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的顏色變淡（圖4A），表明果實(shí)中的葉綠素含量可能出現(xiàn)下降。花后25 d果實(shí)葉綠素含量的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因果實(shí)中的總?cè)~綠素含量確實(shí)顯著降低，僅為野生型的62%（圖4B）。由于番茄果實(shí)中葉綠素及其光合產(chǎn)物主要用于種子的生長(zhǎng)發(fā)育^[18]，因此推測(cè)CWIN活性上調(diào)所導(dǎo)致的果實(shí)葉綠素含量下降可能是造成轉(zhuǎn)基因番茄種子生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制的原因之一。

3 討論

研究表明，高活性的CWIN可促進(jìn)種子或果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育。例如，通過突變或轉(zhuǎn)基因手段降低玉米、水稻或番茄中的CWIN活性導(dǎo)致其種子或果實(shí)的產(chǎn)量降低^[5-8]。相反，通過轉(zhuǎn)基因手段增加CWIN的活性則可增加番茄在熱脅迫下的座果率和產(chǎn)量^[9]。然而，前人在研究CWIN在果實(shí)或種子發(fā)育中的作用時(shí)，大多對(duì)種子或果實(shí)單獨(dú)進(jìn)行研究，很少對(duì)兩者同時(shí)進(jìn)行研究。通過同時(shí)研究CWIN對(duì)種子和果實(shí)發(fā)育的影響，有助于闡明果實(shí)和種子發(fā)育之間的互作和發(fā)育平衡問題，為將來定向提高種子或果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)提供理論依據(jù)。

本文同時(shí)研究了CWIN活性上調(diào)對(duì)番茄果實(shí)和種子生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因手段提高番茄的CWIN活性后，單果鮮重顯著增加，同時(shí)果實(shí)中的葡萄糖和果糖含量上升。但進(jìn)一步對(duì)種子的研究表明，CWIN活性上升導(dǎo)致單個(gè)果實(shí)中的種子數(shù)量下降，同時(shí)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率也顯著下降。這表明CWIN活性上調(diào)在促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)，也抑制了種子的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，番茄果實(shí)和種子生長(zhǎng)發(fā)育之間也存在競(jìng)爭(zhēng)和相互抑制的關(guān)系，這和在豆類上的研究結(jié)果相似^{[12， 19]}。

特別值得注意的是，轉(zhuǎn)基因番茄在單果種子數(shù)量出現(xiàn)下降的情況下，不但單株果實(shí)數(shù)量沒有下降，單果鮮重和果實(shí)己糖含量反而上升。因此本研究表明，可以通過對(duì)蔗糖分解代謝的調(diào)控來促進(jìn)果實(shí)發(fā)育并抑制種子發(fā)育，從而實(shí)現(xiàn)提高番茄果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的最終目的。

CWIN活性上調(diào)促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育、但抑制種子生長(zhǎng)發(fā)育的可能原因有2個(gè)。首先，來自葉片的光合產(chǎn)物主要被用于果實(shí)的生長(zhǎng)，而不是種子的生長(zhǎng)。其次，高活性的CWIN可通過加速分解蔗糖來降低種子或果實(shí)中的蔗糖濃度，從而促進(jìn)蔗糖從光合葉片向種子/果實(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)，為種子或果實(shí)發(fā)育提供更多的能量和碳骨架^{[3， 7]}。例如，Liu等^[9]使用本研究中的轉(zhuǎn)基因番茄為研究材料，發(fā)現(xiàn)CWIN活性上調(diào)可顯著增加熱脅迫下蔗糖向花后2 d果實(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，從而提高了番茄在熱脅迫下的座果率。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因果實(shí)鮮重增加和葡萄糖、果糖含量上升的情況下，其蔗糖含量并沒有下降，這表明CWIN活性上調(diào)可能提高了蔗糖向果實(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)速率和果實(shí)中蔗糖的分解速率。

除上述來源外，轉(zhuǎn)基因果實(shí)中高濃度的己糖（特別是葡萄糖）也可能來自淀粉的分解。植物白天可以把多余的光合產(chǎn)物以淀粉的形式儲(chǔ)存起來供光合效率低的時(shí)候或晚上使用^[3]。轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的淀粉含量在整個(gè)發(fā)育時(shí)期都顯著低于野生型番茄，這表明轉(zhuǎn)基因果實(shí)在分解利用淀粉方面的能力要強(qiáng)于野生型果實(shí)。但無論這些己糖是來自于蔗糖的分解還是淀粉的分解，轉(zhuǎn)基因果實(shí)可以利用的己糖要多于野生型。然而，基于本研究結(jié)果，轉(zhuǎn)基因果實(shí)和種子利用己糖的能力可能并不相同，即這些己糖主要是用于果實(shí)生長(zhǎng)（或儲(chǔ)存于果實(shí)中），而不是用于種子的生長(zhǎng)發(fā)育。

其次，果實(shí)葉綠素含量下降可能導(dǎo)致種子發(fā)育得不到充足的糖分供應(yīng)。前人的研究表明，番茄果實(shí)中葉綠素及其光合產(chǎn)物主要用于種子的生長(zhǎng)發(fā)育，特別是在脅迫情況下。例如，在專一性抑制果實(shí)中谷氨酸-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶（GSA）的表達(dá)后，番茄果實(shí)的葉綠素含量和光合速率出現(xiàn)下降，這導(dǎo)致種子早期發(fā)育進(jìn)程受到不利影響，但對(duì)果實(shí)發(fā)育沒有任何影響^[18]。本研究表明，CWIN活性上調(diào)導(dǎo)致果實(shí)中的葉綠素含量下降，這可能會(huì)導(dǎo)致果實(shí)光合作用下降，從而導(dǎo)致種子得不到充足的糖分供應(yīng)，最終阻礙種子的生長(zhǎng)發(fā)育。

需要指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)CWIN活性上調(diào)對(duì)番茄種子千粒重沒有顯著影響，而Jin等^[13]發(fā)現(xiàn)CWIN活性上調(diào)導(dǎo)致種子單粒重增加22%。2個(gè)研究使用同一轉(zhuǎn)基因材料，而研究結(jié)果卻不相同，這可能是因?yàn)楸狙芯恐兴褂玫霓D(zhuǎn)基因番茄為T4代，而Jin等^[13]使用的是T2代植株。經(jīng)過多代繁殖后，T4代植株可能在表觀遺傳水平上發(fā)生了某些變化，因而導(dǎo)致不同的研究結(jié)果，但需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證該假設(shè)。

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