王鶴 楊娜 徐丹丹 等

摘要 [目的]了解紅柴胡nrDNA序列ITS2片段特征，為中藥柴胡的分子鑒定提供科學(xué)依據(jù)。 [方法]從GenBank中獲取已公布紅柴胡ITS全長序列38條和ITS2序列3條，利用MEGA6.0 進(jìn)行多序列比對(duì)，分析ITS2片段堿基成分、變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)，計(jì)算遺傳距離，并用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。[結(jié)果]ITS2片段長度為224～230 bp，共發(fā)現(xiàn)14個(gè)簡約信息位點(diǎn)，最大遺傳距離0.124，系統(tǒng)樹可明顯分為4組，85.37%的聚為一組。[結(jié)論]ITS2在紅柴胡居群中比較保守，可作為DNA barcoding鑒定的片段使用。

關(guān)鍵詞 紅柴胡;ITS2;遺傳距離;發(fā)育分析

中圖分類號(hào) S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0114-03

Abstract [Objective]Sequence character of nrDNA ITS2 fragment in Bupleurum scorzonerifolium Willd. was analyzed to provide scientific evidence in identification of traditional Chinese medicinal herb chaihu.[Method]Fortyone sequences including thirtyeight full length ITS and three ITS2 fragments were downloaded from GenBank.Nucleotide composition，variable sites，parsimony informative sites were analyzed after alignment in MEGA6.0.Meanwhile，the genetic distances were computed using Kimura2parameter （K2P） model and phylogenetic tree was constructed using the neighborjoining （NJ） method.[Result]The length of ITS2 varied from 224 bp to 230 bp including 14 parsimony informative sites，and the maximum K2P distance was 0.124.Four clades were grouped in NJ tree among which 85.37% sequences clustered in clade IV.[Conclusion]ITS2 is an ideal sequence in chaihu identification for its conservatism among B.scorzonerifolium populations.

Key words Bupleurum scorzonerifolium Willd.;ITS2;Genetic distance;Phylogenetic analysis

紅柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）是《中國藥典》收錄的中藥柴胡的2種基源植物之一，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣功效[1]。紅柴胡廣布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、山東、山西、陜西、江蘇、安徽、廣西及內(nèi)蒙古、甘肅諸省區(qū)，在俄羅斯遠(yuǎn)東、蒙古、朝鮮至日本也有分布[2]。雖然柴胡屬的多數(shù)種類在國內(nèi)各地均作為藥材收購使用，但藥性的差異仍不容忽視，因此，對(duì)紅柴胡基源植物的準(zhǔn)確鑒定依然是值得關(guān)注的問題。

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（internal translation spacer，ITS） 由于所受選擇壓力小、堿基替換較快、協(xié)同進(jìn)化，且具有拷貝數(shù)大等特點(diǎn)，在植物種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)演化、遺傳多樣性等研究中被廣泛應(yīng)用[3-5]。ITS2 片段是位于5.8S 序列和 28S序列之間的nrDNA間隔區(qū)，片段短且易擴(kuò)增、測序，變異位點(diǎn)能夠保證其鑒定能力及鑒定的成功率，其具有良好的通用性，在多個(gè)科屬基源植物及藥材的鑒定中已得到了驗(yàn)證，被認(rèn)為是最適合作為DNA 條形碼的片段[6-10]。筆者基于GenBank數(shù)據(jù)對(duì)紅柴胡nrDNA序列ITS2片段進(jìn)行分析，以期為中藥柴胡的分子鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GenBank中下載已公布的所有紅柴胡ITS全長序列38條和ITS2序列3條，與柴胡屬標(biāo)準(zhǔn)ITS2序列對(duì)比，確定共計(jì)41條ITS2序列長度邊界后作為該研究的DNA序列。

1.2 數(shù)據(jù)處理

首先，將序列導(dǎo)入MegAlign （Lasergene7.1）[11]，另存成.fas文件后，將所有序列用軟件MEGA6.0[12]進(jìn)行多序列比對(duì)，分析ITS2序列堿基成分、變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)，利用Kimuras雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，并用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，Bootstrap設(shè)置1 000 次重復(fù)檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征與ITS2多態(tài)性

紅柴胡的ITS2序列長度為224～230 bp，比對(duì)后長度為230 bp，含3處插入/缺失。 其中，KF573806長度為224 bp，AY551294長度為226 bp，其余39條序列均為230 bp，平均為229.8 bp，長度變異較小。GC含量占總核苷酸堿基的60.3%。共檢測到32個(gè)變異位點(diǎn)，單變異位點(diǎn)18個(gè)，簡約信息位點(diǎn)14個(gè)（表1）。

2.2 遺傳距離