隋鑫　劉麗　賈美清　宋洋　王嘉寶　劉美琪　張國剛

摘 ? ?要：氣候“變干”和“變暖”是影響內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)的2個關(guān)鍵氣候限制因子。為了明確氣候變化對荒漠草原土壤微生物群落數(shù)量及多樣性的影響，本研究在荒漠草原開展大面積人工增溫及干旱模擬，應(yīng)用稀釋平板法及微生物PCR分子鑒定技術(shù)，研究不同土壤深度可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量以及多樣性。結(jié)果表明：溫度增加會使0～30 cm土壤細(xì)菌數(shù)量減少，且表層數(shù)量變化強烈，中深層相對穩(wěn)定。干旱缺水同樣使0～30 cm土壤細(xì)菌數(shù)量減少，但水分增加后，土壤細(xì)菌數(shù)量快速上升，表層變化更為明顯。氣候變干變暖對土壤細(xì)菌的群落多樣性影響較輕微，無顯著差異。不同處理的土壤細(xì)菌群落物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均呈現(xiàn)出：增溫處理>溫度對照處理;減水處理>水對照處理>增水處理的趨勢，均勻度指數(shù)呈現(xiàn)出增溫處理>溫度對照處理;減水處理>水分對照處理>增水處理的趨勢。這主要是因為高溫和缺水的環(huán)境中激發(fā)了一些土壤細(xì)菌的生長，使分布較均勻，這可以作為指示細(xì)菌為以后深入研究荒漠草原的微生物變化提供一定的資料。

關(guān)鍵詞：人工增溫;干旱模擬;土壤細(xì)菌;群落多樣性

中圖分類號：S812.2 ? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.006

Responses of Soil Bacteria Quantity and Diversity to Drought and Warming in ?Stipa breviflora Desert Steppe

SUI Xin1，LIU Li1，JIA Meiqing2，SONG Yang1，WANG Jiabao1，LIU Meiqi1，ZHANG Guogang1

（1.Life Science College， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China;2.Tianjin Key Laboratory of Water Resources and Environment， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

Abstract： Drying and warming are two key climatic limiting factors affecting grassland ecosystem in Inner Mongolia. In order to clarify the effects of climate change on the quantity and diversity of soil microbial communities in desert steppe， large-scale artificial warming and drought simulation were carried out in desert steppe. Dilution plate method and PCR molecular identification of microorganisms were used to study the number and diversity of soil bacteria in different soil depths after drying and warming. The results were as follows： the increase of temperature reduced the quantity of bacteria in 0～30 cm soil， and the quantity of surface layer changed strongly， and the deeper layer was relatively stable. Drought also reduced the number of soil bacteria in 0～30 cm soil， but the number of soil bacteria increased rapidly with the increase of water content， especially in the surface layer. Climate warming and drying had little effect on soil bacterial community diversity. The species diversity index and evenness index of bacterial community in different treatments showed the following trends： warming treatment > temperature control treatment; reducing water treatment > water control treatment > increasing water treatment; evenness index showed the trend of warming treatment > temperature control treatment; reducing water treatment > water control treatment > increasing water treatment. The main reason was that high temperature and lack of water environment stimulated the growth of some soil bacteria， so that the distribution was more uniform， which could be used as indicator to provide information in further study of soil bacteria in Stipa breviflora desert steppe.

Key words： ?artificial warming; drought simulation; soil bacteria; community diversity

在全球氣候變暖的大背景下，中國草原區(qū)近50年氣候日趨變暖，以冬季升溫幅度最大[1-3];增溫和降水變異增大，導(dǎo)致草原牧區(qū)干旱化加劇，近90%的草原出現(xiàn)了不同程度的退化[3]。中國的荒漠草原主要分布在北部的干旱和半干旱區(qū)，是對氣候變化最為敏感的草原類型。從20世紀(jì)后40年間氣象站記載的氣溫和降水變化特征分析，處于中國北方中緯度區(qū)域的荒漠草原區(qū)年平均氣溫表現(xiàn)出上漲趨勢， 是北半球中緯度地區(qū)升溫的一個非常好的例子。降水則表現(xiàn)為長年波動狀態(tài)，春季、冬季降水有明顯減少的趨勢[4]。20世紀(jì)50年代以來，氣溫升高、降雨量減少，造成了嚴(yán)重的水分虧損，正在明顯地影響著草原生態(tài)系統(tǒng)。氣候變化的“變干”和“變暖”是草原生態(tài)系統(tǒng)中兩個關(guān)鍵限制因素[5]。因此，氣候變化對草原生態(tài)系統(tǒng)的影響已經(jīng)成為研究焦點。但當(dāng)前的研究多為氣候變化對草原生產(chǎn)力、植被及群落組成等的影響[6]，而對草原區(qū)土壤微生物與環(huán)境變化的研究相對較少[4，6-8]。

草原是以土-草-畜為主體構(gòu)成的一個相對獨立的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物在草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)中有很重要的作用，也是反應(yīng)環(huán)境變化的敏感指示生物，其數(shù)量和種群組成是評價草地土壤環(huán)境質(zhì)量的重要參數(shù)之一[9]。土壤中微生物數(shù)量繁多，種類豐富，而土壤細(xì)菌相對其他微生物來說其數(shù)量和種類更多。土壤微生物是土壤有機質(zhì)的主要分解者，同時許多微生物具有固氮、溶磷、分解鉀素等作用，因此，土壤微生物在草地生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高方面具有十分重要的作用。由于微生物的微觀性，結(jié)構(gòu)簡單、繁殖速度快，缺少準(zhǔn)確的基線用于種群數(shù)量統(tǒng)計等原因，人們對它們的研究遠(yuǎn)沒有像宏觀生物那樣受到重視，而對于草地土壤微生物的研究就更加滯后，1980年以前關(guān)于草地土壤微生物研究報道極少，近20多年來，才受到一些學(xué)者的關(guān)注。因此，加強對草地微生物多樣性和功能的研究，特別是加強氣候變化與微生物關(guān)系研究，對恢復(fù)草地生態(tài)系統(tǒng)的生物學(xué)功能，實現(xiàn)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地設(shè)在內(nèi)蒙古自治區(qū)中部、烏蘭察布市西北部的四子王旗，地處北緯41°10′～43°22′，東經(jīng)110°20′～113°，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫1～6 ℃，1月最冷，平均氣溫自北向南由-14 ℃遞降到-17 ℃。極端最低氣溫-39 ℃，7月最熱，平均氣溫自南向北由16 ℃遞升到24 ℃。極端最高氣溫35.7 ℃。積年平均降水量110～350 mm。四子王旗以畜牧業(yè)為主，資源豐富，植被類型為典型的荒漠草原，建群種為短花針茅（Stipa breviflora），優(yōu)勢種為冷蒿（Artemisia frigida）和無芒隱子草（Cleistogenes songorica），伴生種主要有木地膚 （Kochia prostrata）、阿氏旋花（Apgar bindweed）、細(xì)葉蔥（Allium tenuissimum）、羊草（Leymus chinensis）、狹葉錦雞兒（Caragana stenophylla）和小葉錦雞兒（Caragana microphylla）等。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 增溫試驗 如圖1A所示，增溫試驗是在荒漠草原上建立12個3 m×4 m的小區(qū)，其中6個小區(qū)上方2.25 m高處放置紅外加熱器;紅外加熱器所放高度保證其不會對土壤微生物產(chǎn)生影響;每個小區(qū)的間隔為4 m，避免重復(fù)加溫;每個小區(qū)不同的土壤深度設(shè)置土壤溫度測定儀，根據(jù)土壤及地表溫度確定加熱強度。試驗設(shè)增溫處理（T）及增溫對照處理（Tck），6次重復(fù)，小區(qū)隨機分布。增溫?zé)艄荛L邊方向為南北方向，燈管離地面高度為2.25 m。利用燈管加熱保證增溫處理區(qū)地表溫度增溫1.5 ℃。

1.2.2 干旱模擬試驗 如圖1B所示，干旱模擬試驗與增溫試驗在相同的地點，保證相同的草原類型及氣候條件，建立12個6 m×15 m小區(qū)，其中在對照處理區(qū)每一個重復(fù)內(nèi)設(shè)1個2 m×4 m的旱棚，旱棚頂部的開放面積為總面積的一半，用來模擬干旱的氣候條件;旱棚收集的雨水用于增水處理區(qū)。每一小區(qū)土壤中設(shè)立自動水分測定儀，動態(tài)測定不同土壤深度的水分含量改變情況。每一試驗都設(shè)有空白對照區(qū)，并保證對照及各處理區(qū)間在年內(nèi)據(jù)有相同的農(nóng)事活動?？厮囼炘O(shè)對照處理（WCK）、增水處理（+W）、減水（-W）處理，6次重復(fù)，各小區(qū)隨機分布。其中增水處理為增加當(dāng)年自然降雨量的一半水量，減水處理為減少到年度自然降雨量的一半。

1.3 主要儀器和試劑

主要儀器：天馬牌TD型電子天平、50 mL離心管、SW-CJ-1F雙人單面凈化工作臺、Finn pipette單道移液器、YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、HY-4多用調(diào)速振蕩器、JCZ-GPL050B智能程控型干燥/培養(yǎng)兩用箱、Tocan透射防護蓋紫外分析儀及成像系統(tǒng)、Blue Marlin TC-960F PCR儀等。

主要試劑：pH試紙、Para film PM-996封口紙、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、無水乙醇、KH2PO4、MgSO₄·7H₂O、孟加拉紅、青霉素、可溶性淀粉、KNO₃、K₂HPO₄、NaCl、FeSO₄·7H₂O、1 mol·L^-1NaOH溶液、EB染液、超純水等。

1.4 試驗方法

1.4.1 土樣采集 本研究地點選在內(nèi)蒙古農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗野外定位站，在荒漠草原上進行人工增溫水分控制試驗，即采用紅外加熱器和人工化旱棚模擬不同氣候變化，并設(shè)置空白對照區(qū)進行對比。本研究土樣采自2012年8月初，包括增溫處理、增溫對照處理、增水處理、減水處理和水分對照處理。每處理隨機選取多個樣點，用土鉆在每一個點取0～2，2～5，5～10，10～20，20～30 cm 5層土樣各約30 g，用封口塑料袋密封，并在最短時間內(nèi)帶回實驗室放于冰箱中，在冷凍條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 土壤細(xì)菌的培養(yǎng)方法 采用稀釋平板法對土樣進行分離，計數(shù)。采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[10]對土樣細(xì)菌進行培養(yǎng)，經(jīng)過預(yù)試驗確定細(xì)菌計數(shù)在30～300菌落數(shù)的稀釋濃度是4～10 g·mL^-1，此時不僅菌落利于計數(shù)，而且分離充分、特征明顯。每個處理的土樣稀釋液設(shè)3個重復(fù)，涂布均勻后，將平板倒置放在溫度為28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，根據(jù)菌落特征進行初步分類、拍照和編號并進行菌落計數(shù)，最后挑選生長良好、有代表性的菌落進行分離與純化。

1.4.3 土壤細(xì)菌的分子鑒定 用土壤DNA提取試劑盒提取菌落的DNA，以其為模板進行PCR擴增，所用的引物序列為341F-GC （5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GCG AGG CAG CAG-3′） 57 bp和 534R （5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′） 17 bp。

PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×Es Buffer（含Mg²⁺） 5 μL;dNTP 4 μL（各2.5 mmol·L^-1），上游引物2 μL，下游引物2 μL，Tap Es DNA聚合酶0.5 μL（5 U·μL^-1），模板1 μL（10 ng·μL^-1），加超純水至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，30次循環(huán)：94 ℃變性 1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃下延伸10 min。擴增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

細(xì)菌16sDNA電泳檢測出條帶的PCR產(chǎn)物送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI中的BLAST里面的GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析，找出相似度最高的序列，使用CLASTALX進行比對，根據(jù)其與已知菌種16S DNA序列的相似性來進行菌種分類與鑒定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Sigmaplot13.0進行數(shù)據(jù)的圖表處理， 利用SPSS13.0進行單因素方差、（One-Way ANOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣候變干、變暖條件下土壤細(xì)菌數(shù)量的變化

為了明確增溫對草原土壤細(xì)菌數(shù)量的影響，比較了溫度對照處理與增溫處理土壤細(xì)菌在不同土壤深度的差異。由圖2可知，在土層0～2，2～5，5～10和20～30 cm中，增溫組的土壤細(xì)菌數(shù)量低于空白對照組。其中僅在表層土壤0～2 cm和2～5 cm存在顯著性差異，分別下降了32.94%，1.52%。在0～2 cm土層中溫度對照處理細(xì)菌數(shù)量較多，與增溫處理細(xì)菌數(shù)量相差最大。究其原因，可能是0～2 cm表層土受溫度影響最大，由于人工增溫導(dǎo)致0～2 cm表層土的溫度超過部分細(xì)菌的最適生長溫度，從而細(xì)菌數(shù)量迅速減少。在10～20 cm中，增溫反而增加了土壤中細(xì)菌的數(shù)量，且存在顯著性差異。綜合考慮，增溫處理后該土層深度的土壤溫度比對照處理的稍高，其正好適宜細(xì)菌生長。20～30 cm土層中二者相差較小，可能是深層土壤的溫度及理化性質(zhì)比較穩(wěn)定。整體來看，在0～30 cm土壤中，增溫顯著降低了土壤細(xì)菌數(shù)量。與空白對照相比，增溫組土壤細(xì)菌數(shù)量下降了8.40%。說明，在人工增溫的試驗條件下，高溫會對土壤部分細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制，造成其數(shù)量相對較少。

在水分試驗中，對比3個處理結(jié)果可見：在5個土層中，0～2，2～5，5～10 cm土壤細(xì)菌數(shù)量均呈現(xiàn)：增水處理>水分對照處理>減水處理。增水處理增加了土壤表層的細(xì)菌數(shù)量，對中深層影響不顯著。其中，0～2，2～5，5～10 cm土層中，與空白對照組相比，增水組土壤細(xì)菌數(shù)量分別增加了12.40%，11.05%，4.94%。隨著土層加深，增水對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響逐漸減弱。整體來看，0～30 cm中增水組的土壤細(xì)菌數(shù)量增加了2.82%，差異不顯著。0～2，2～5，5～10 cm中，減水組的土壤細(xì)菌數(shù)量與對照相比分別下降了23.14%，12.11%和5.35%。原因可能是表層土壤中干旱缺水會影響部分細(xì)菌的生長，導(dǎo)致數(shù)量較少，且0～2 cm土壤層的水分相差最顯著。在10～20，20～30 cm土層中，3個處理的細(xì)菌數(shù)量差別較小，趨于平衡，主要是由于隨著土層深度的增加，土壤中的水分狀況比較穩(wěn)定，3個處理的差別較小。整體來看，0～30 cm土壤細(xì)菌總量在降雨量減少一半之后下降了9.62%。

總體而言，高溫和缺水會對土壤細(xì)菌的生長條件產(chǎn)生很大的負(fù)面作用，導(dǎo)致其數(shù)量與對照區(qū)相比有所下降。首先，溫度增加會使土壤可培養(yǎng)細(xì)菌減少約5.5×106 cfu·g^-1，與對照相比降低6.16%;而干旱缺水土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量將減少7.5×106 cfu·g^-1，與對照相比降低9.62%。對比發(fā)現(xiàn)缺水對于土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響稍大一些，主要因為缺水對細(xì)菌數(shù)量影響較大。同時發(fā)現(xiàn)在人工增水處理情況下，與減水處理相比，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量會有一定的恢復(fù)，并且稍多于水分對照處理?？梢姼珊登闆r在增水處理之后，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌會得到相應(yīng)的改善，其恢復(fù)力也較強。

2.2 土壤細(xì)菌種屬鑒定結(jié)果

經(jīng)過鑒定，取樣土壤中的土壤細(xì)菌類群包括芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌（Arthrobacter spp.）、黃桿菌（Flavobacterium sp.）、耐鹽節(jié)桿菌（Arthrobacter pascens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）、金色桿菌（Chryseo bacterium sp.）、雙歧桿菌屬（Bifido bacterium sp.）、污泥顆粒菌（Sludge granule bacterium）、產(chǎn)氫菌（Clostridium sp.）。其中芽孢桿菌屬包括嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alcalophilu）、臘狀芽孢桿菌（B.cereus）、球形芽孢桿菌（B.spaericus）、泛酸芽孢桿菌（B.pantothenticus），且在各處理中芽孢桿菌屬均占絕對優(yōu)勢，占細(xì)菌總量的80%。

2.3 氣候變干、變暖條件下土壤細(xì)菌多樣性的變化

圖3說明，氣候變干變暖條件下不同土層細(xì)菌群落的多樣性。其中增溫處理中，除10～20 cm土層外，其余土層土壤中細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均高于空白對照，優(yōu)勢度指數(shù)低于空白對照。說明增溫使土壤細(xì)菌群落多樣性略微增高，但差異不顯著。但是在20～30 cm的深層土壤中細(xì)菌群落的物種多樣性都趨于相似。這主要與表層土壤環(huán)境受外界環(huán)境影響較大，尤其是在溫度升高的情況下，會刺激一些細(xì)菌類群的生長，而深層土壤理化性質(zhì)相對穩(wěn)定有關(guān)。

在減水處理中，土壤表層即0～2， 2～5， 5～10 cm中，土壤細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均高于空白對照和增水處理，優(yōu)勢度指數(shù)均低于空白對照和增水處理。說明減水處理使土壤細(xì)菌群落的多樣性有增高的趨勢，且高于增水處理的效果，但差異不顯著。隨著土壤深度的增加，3個處理之間的多樣性指數(shù)差距相對較小。說明土壤表層受土壤水分的影響比較明顯，深層土壤受其影響較小。

在增水處理中，除0～2， 5～10 cm外，其余土層土壤中細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均低于空白對照，優(yōu)勢度指數(shù)均高于空白對照。在0～30 cm土層中，土壤細(xì)菌群落的Shannon-wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均低于空白對照，優(yōu)勢度指數(shù)高于空白對照。說明增水處理對中深層土壤細(xì)菌群落的多樣性有輕微的負(fù)面影響，但差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，氣候變化對內(nèi)蒙古荒漠草原土壤細(xì)菌的數(shù)量產(chǎn)生了一定的影響。增溫和干旱導(dǎo)致0～30 cm深度土壤細(xì)菌數(shù)量有所下降，而水分增加一半后，土壤細(xì)菌數(shù)量快速增加。研究表明，土壤微生物具有很強的恢復(fù)力，能在加水后的幾天甚至幾小時內(nèi)快速恢復(fù)[11]。還有研究表明，適當(dāng)?shù)臏囟壬邥黾油寥兰?xì)菌的數(shù)量，但是超過其最適生長溫度范圍，土壤細(xì)菌數(shù)量就有一些種類的細(xì)菌數(shù)量稍有一些減少[12]。水分條件充足有利于土壤細(xì)菌的生長繁殖。因而，隨著近年來內(nèi)蒙古地區(qū)荒漠草原環(huán)境的惡化，尤其是缺水嚴(yán)重，會影響土壤中細(xì)菌的數(shù)量，使其有一定程度的減少。本研究還發(fā)現(xiàn)在五區(qū)樣地的0～20 cm土層土壤細(xì)菌數(shù)量明顯多于20～30 cm土層，二者相差10倍左右。表現(xiàn)為隨土層深度的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量呈明顯下降的趨勢，這與大多數(shù)的研究結(jié)果相一致[13]，主要因為土壤表層牧草根系分布密集，根系分泌物和枯枝落葉積累多，營養(yǎng)和水熱條件比深層土壤好，有利于細(xì)菌的生長和繁殖。

四子王旗試驗樣地的不同處理中土壤細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)都有一定的差異。該區(qū)土壤細(xì)菌種類多，各樣點差異不大。溫度對照處理比增溫處理的細(xì)菌優(yōu)勢度指數(shù)略高，而細(xì)菌物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)增溫處理高于對照處理，但差異不顯著。類似的結(jié)果在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)，短期的增溫對土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)影響較為明顯，但多樣性和豐富度影響不大[14]。

增減水與對照區(qū)相比，細(xì)菌物種多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)大致呈現(xiàn)：減水處理>對照處理>增水處理的趨勢，水分對照處理優(yōu)勢度指數(shù)最高，增減水兩區(qū)差別不顯著。說明在內(nèi)蒙古荒漠草原，減水區(qū)土壤中物種多樣性指數(shù)相對較高，表層更為明顯，隨土層加深各指數(shù)也是趨于相同。可能是因為干旱會導(dǎo)致某些細(xì)菌種類數(shù)量分布較均勻。

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