白玉路, 王 平，張 瓊，張志勇，徐登武，蒲志剛，王閔霞

(四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所, 四川 成都 610066)

【研究意義】稻瘟病是水稻的主要病害之一，每年都會造成大量的損失。生產(chǎn)實踐表明，利用抗稻瘟病親本培育并種植抗稻瘟病品種是控制稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法[1]。然而水稻稻瘟病菌生理小種變異快，使得具有單一抗病基因的品種容易喪失抗性，長期實踐證明，利用優(yōu)良的抗性基因資源，進行基因聚合拓寬其抗譜是培育水稻抗病親本與品種的關鍵，也是對抗水稻病害最為經(jīng)濟、安全和有效的方法。【前人研究進展】目前，至少有69個抗稻瘟病位點共84個主效基因已被定位，這些基因成簇地分布于除第3染色體外的所有水稻染色體上。前人研究表明，Pi2、Pita以及Pik是目前重要的稻瘟病抗性基因位點，其在抗稻瘟病育種材料選育方面具有重要應用價值，育種家已經(jīng)利用Pi2、Pik以及Pita等基因成功選育出一系列抗稻瘟水稻新材料[2-12]。近年來，多個研究人員將Pi1、Pi2、Pigm、Pi40、Pita、Pib、Pi9以及Pi49等抗稻瘟病病基因與其它抗病、米質(zhì)相關基因進行聚合，創(chuàng)制出了一系列高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗水稻新材料，為培育優(yōu)質(zhì)、多抗水稻新品種奠定了豐富的材料基礎[13-17]。【本研究切入點】川恢907是四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所通過遠緣雜交、輻射誘變結(jié)合花藥培養(yǎng)技術選育出的大穗高配合力強優(yōu)勢水稻三系骨干恢復系，含有抗稻瘟病基因Pik和廣譜抗病基因Pita，已配出多個雜交水稻新品種通過國家和省級審定，具有良好的應用價值[18]。多年來，川恢907與田間稻瘟病菌生理小種的不斷互作，其抗性逐年下降，配制的雜交水稻組合稻瘟病抗性愈來愈差，限制了其在生產(chǎn)上的推廣應用。為了保持川恢907的持久抗病性，本研究以含有廣譜抗稻瘟病基因Pi2的優(yōu)質(zhì)恢復系五山絲苗為抗稻瘟病基因供體，川恢907為擬改良受體，通過常規(guī)雜交、回交和自交，以及基于高分辨率熔解曲線(HRM)的分子標記輔助選擇技術(MAS)，將Pi2基因?qū)氲焦歉苫謴拖荡ɑ?07中，聚合抗稻瘟病基因Pik、Pita和Pi2?！緮M解決的關鍵問題】通過本研究實現(xiàn)抗病基因有效聚合累加，拓寬抗譜提高其抗稻瘟病能力，并保持其他農(nóng)藝性狀不變，實現(xiàn)川恢907稻瘟病抗性的精準改良，延續(xù)其強優(yōu)勢配合力，為選育出更多的優(yōu)良雜交水稻新品種提供廣譜抗病的高配合力恢復系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Pi2基因受體親本及輪回親本川恢907，含有抗稻瘟病基因Pik、Pita，由四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所自育；Pi2基因供體親本五山絲苗，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所提供；稻瘟病感病對照CO39，由四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 抗稻瘟病基因分子檢測

基于HRM技術體系的Pik、Pita和Pi2基因分子標記參考羅文龍等開發(fā)的功能型分子標記[19](表1)，并采用巢式PCR 進行擴增。每個位點分別設計外部和內(nèi)部引物進行2 輪PCR。巢式PCR 的第1 輪PCR 擴增，以基因組DNA 為模板，利用外部引物擴增；擴增體系：2×TaqMaster Mix 5 μl，External Primer 0.3 μl，模板DNA0.6 μl，用ddH2O補足10 μl體系；PCR反應程序為95 ℃ 3 min；然后35個循環(huán)：95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min; 最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。待反應完成后，向PCR 管分別加入50 μl雙蒸水，以稀釋PCR產(chǎn)物(約5倍)。第2 輪PCR，擴增體系：2×TaqMaster Mix 4 μl，Internal Primer 0.25 μl，模板DNA 0.6 μl，熒光染料Evagreen 0.4 μl，高溫、低溫內(nèi)標各1 μl，用ddH2O補足10 μl體系；PCR反應程序為95 ℃ 3 min；然后20個循環(huán)：95 ℃ 15 s，57 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s; 最后95 ℃解鏈2 min，40 ℃ 1 s。

1.3 抗稻瘟病基因聚合改良系的培育

以五山絲苗作為Pi2基因供體，與被改良材料川恢907雜交，再以川恢907為輪回親本，連續(xù)回交5代獲得BC5F1，再自交3代獲得BC5F4。從BC1F1開始，每代連續(xù)采用基于HRM體系的Pik、Pita和Pi2基因功能型分子標記進行輔助選擇，篩選出含有Pik、Pita和Pi2基因且與川恢907農(nóng)藝性狀相似的單株材料進行連續(xù)回交、自交，直到完全穩(wěn)定。

1.4 抗稻瘟病基因聚合改良系DNA指紋圖譜鑒定

根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1433-2014中48對SSR引物對基因聚合改良系和川恢907進行指紋圖譜鑒定。通過隨機選取混合樣，采用CTAB方法提取基因組DNA，PCR反應體系為10 μl，10×Taqbuffer 1.0 μl (Mg2+)，2 mmol/L dNTPs 1.0 μl，10 μmol/L正反向SSR引物各0.75 μl，模板DNA 20 ng。反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃DNA變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。擴增產(chǎn)物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠中恒壓電泳，銀染檢測[20]。

表1 抗稻瘟病基因分子標記引物序列

1.5 抗稻瘟病基因聚合改良系稻瘟病田間抗性鑒定

2017-2018年將從BC5F4篩選獲得的聚合了3個抗病基因Pik、Pita和Pi2并且DNA指紋圖譜一致的的改良系、川恢907及稻瘟病感病對照CO39在邛崍?zhí)炫_山鎮(zhèn)稻瘟病抗性鑒定圃進行稻瘟病田間抗性鑒定，4月中旬播種，5月中下旬移栽，每個材料設3次重復，每次重復30穴，采用稻瘟病自然誘發(fā)接種鑒定，全生長期不施用殺菌劑，肥水管理按一般高產(chǎn)栽培管理。于稻瘟病盛發(fā)期調(diào)查各材料葉瘟及穗頸瘟發(fā)病率、損失率、綜合抗病指數(shù)。以發(fā)病最為嚴重的重復作為該材料的最終調(diào)查數(shù)據(jù)。

1.6 抗稻瘟病基因聚合改良系主要農(nóng)藝性狀差異分析

2018 年4月，將改良系與川恢907種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園，試驗實行隨機區(qū)組排列，設置 3 次重復，每個重復100穴。栽插密度為行距30 cm、株距17 cm，常規(guī)田間管理。每個重復定點取3個單株，調(diào)查生育期、株葉型、穗型、粒型和株葉顏色等農(nóng)藝性狀，對株高、劍葉長、劍葉寬、穗長、穗粒數(shù)、實粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重等主要農(nóng)藝性狀進行差異性比較，并通過T檢驗方法分析改良系與川恢907之間主要農(nóng)藝性狀差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻瘟病基因聚合改良系的培育與抗病基因檢測

2014年夏季在四川省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園配制川恢907×五山絲苗雜交F1組合，2014年秋季種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院英州南繁基地，抽穗前通過HRM分子檢測將含Pik、Pita和Pi23個目的單株，以川恢907作輪回親本配制川恢907//907/五山絲苗回交組合，接著2014年冬季在英州南繁基地種植回交組合，2015年春季抽穗前通過HRM分子檢測全部單株，選擇含Pik、Pita和Pi23個目的基因且外觀農(nóng)藝性狀與川恢907基本相似的部分單株再與川恢907進行回交，每年每個世代如此操作。每年成都夏季種植1季，海南秋天和冬天分別種植1季，每季種植回交組合10個以上，單株在200株以上，直到2015年秋季在海南種植BC4F1，在種植的株系中選擇出3個群體基本穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀較一致的株系進行抗病基因檢測，選取部分單株初步進行DNA相似性分析，共檢測出5個單株與川恢907的差異位點為0或1個，2015年冬季在海南選擇含有3個目的基因并且無差異位點的單株再與907回交獲得BC5F1，接著對回交的組合在成都和海南連續(xù)自交3代，自交每代進行相似性鑒定，篩選無差異位點的進行自交，直到2017年春季獲得BC5F4, 經(jīng)DNA相似性檢測和農(nóng)藝性狀鑒定，從中篩選獲得1份含有3個純合目的基因且外觀農(nóng)藝性狀與川恢907一致且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的抗稻瘟病基因聚合改良系69235-4-10，定名為新川恢907。

2.2 新川恢907 DNA指紋圖譜鑒定

以農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 1433-2014中48對SSR引物對25株新川恢907與原始被改良材料川恢907進行DNA指紋圖譜鑒定。結(jié)果表明，2個材料48對引物的擴增產(chǎn)物帶型表現(xiàn)一致，新川恢907與川恢907之間DNA指紋圖譜無差異。部分分子標記對BC5F4材料與川恢907的相似性鑒定見圖1。

2.3 新川恢907稻瘟病田間抗性鑒定

2017-2018年，分別對川恢907、新川恢907以及感病對照CO39在邛崍市天臺山鎮(zhèn)稻瘟病抗性鑒定圃進行田間抗性鑒定。通過對葉瘟發(fā)病率、葉瘟病級、穗頸瘟發(fā)病率以及損失率的調(diào)查，結(jié)果表明：新川恢907葉瘟發(fā)病率、葉瘟病級、穗頸瘟發(fā)病率、損失率以及綜合抗病指數(shù)顯著低于被改良材料川恢907(表2)。由此可以看出，多基因聚合顯著提高了川恢907的田間稻瘟病抗性。

1～2：2株川恢907單株；3～27：25株新川恢907單株1-2: Two plants of Chuanhui 907; 3-27:Twenty-five plants of new Chuanhui 907圖1 部分分子標記對新川恢907與川恢907 DNA指紋圖譜鑒定 Fig.1 Identification of partial SSR molecular markers between new Chuanhui 907 and Chuanhui 907

表2 新川恢907田間抗性鑒定結(jié)果

2.4 新川恢907與川恢907之間主要農(nóng)藝性狀差異分析

通過對新川恢907與川恢907的農(nóng)藝性狀調(diào)查，新川恢907全生育期150.6 d，川恢907全生育期150.2 d，二者相當；其株葉型、葉色等外觀農(nóng)藝性狀也無明顯差異；同時，對株高、穗長、穗粒數(shù)、實粒數(shù)等12個農(nóng)藝性狀拷種測量并進行T檢驗，比較其差異顯著性，結(jié)果表明：在12個測量的主要農(nóng)藝性狀中P值在0.1～0.5之間的性狀有8個，大于0.5的性狀有4個。新川恢907與川恢907之間各外觀農(nóng)藝性狀不存在顯著差異(圖2，表3)。

3 討 論

通過利用攜帶不同抗稻瘟病基因的材料，采用雜交、回交和分子輔助選擇技術結(jié)合聚合抗病基因改良水稻稻瘟病的抗性，培育出廣譜抗稻瘟病的材料是可行的。黃艷玲等[21]、向聰?shù)萚22]、裘燁等[23]通過分子輔助選擇技術分別將Pi9基因、Pigm基因、Pi-kh基因?qū)敫胁〉膬上挡挥祷蚧謴拖抵?，選育出了稻瘟病抗性顯著增強的不育系或恢復系材料。本研究采用雜交、回交、自交與基于HRM的分子標記輔助選擇技術相結(jié)合的方法，將抗稻瘟病基因Pi2導入到含有抗稻瘟病基因Pik和Pita基因的川恢907中，選育出了稻瘟病抗性顯著提高的新川恢907。

通過雜交、多次回交、自交，結(jié)合分子標記輔助選擇技術和基因型相似性分析，能精確改良優(yōu)良水稻恢復系的抗性，并能保持原材料的全部優(yōu)良性狀。在以往的報道中，基本上都是通過雜交或回交，結(jié)合分子輔助選擇技術，選育出抗病性增強的新的育種材料，對骨干恢復系或不育系的精準改良罕見報道。川恢907精準改良的成功為其他恢復系抗性改良乃至不育系抗性、米質(zhì)等精準改良上提供了可行的借鑒，其新川恢907和原川恢907所配組合的雜種優(yōu)勢及抗性表現(xiàn)等研究工作正在進行中。

圖2 新川恢907與川恢907對比Fig.2 Comparion between new Chuanhui 907 and Chuanhui 907

表3 新川恢907與川恢907主要農(nóng)藝性狀差異顯著性分析

對優(yōu)良水稻品種和材料的精確改良，需要不斷發(fā)掘新的優(yōu)良基因，開發(fā)新的分子標記和檢測技術。為了保持優(yōu)良水稻品種持久抗病性，就需要對新發(fā)現(xiàn)的抗稻瘟病基因，通過雜交、回交和分子輔助選擇技術不斷進行基因聚合累加、結(jié)合基因型相似性分析做出精確改良。在改良川恢907中，回交了5次，自交了3次，如何加快材料的改良速度，提高選育效率，回交和自交多少代次才能保證和原材料基因型相似，將進一步進行研究。

4 結(jié) 論

本研究以攜帶有含廣譜抗病基因Pi2的五山絲苗為供體，以攜帶有抗稻瘟病基因Pita、Pik的川恢907為受體，通過上述方法對川恢907的稻瘟病抗性進行了精確改良，獲得了含有3個目的基因的改良恢復系新川恢907，以NY/T 1433-2014中48對SSR引物對其進行指紋圖譜鑒定，背景與川恢907無差異，通過T檢驗主要農(nóng)藝性狀無明顯差異，并且稻瘟病抗性較川恢907顯著提升，表明川恢907精準改良獲得成功。