薛文俊 曹欣宇 吳瓊 云月英 烏日罕 賀喜格 包旺山 格日勒?qǐng)D

摘 要：采用自然放牧條件下的6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊，取其半腱?。⊿emitendinosus，ST）和背最長(zhǎng)?。↙ongissimus dorsi，LD），提取并分離純化肌內(nèi)結(jié)締組織中的Ⅴ型膠原蛋白。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、熱變性溫度和氨基酸組成分析，比較各月齡段肉羊不同部位中Ⅴ型膠原蛋白的特性。結(jié)果表明：Ⅴ型膠原蛋白主要由α1（Ⅴ）、α2（Ⅴ）、α3（Ⅴ） 3 種亞基組成;ST和LD肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量隨著月齡的增長(zhǎng)而增加，且各月齡間差異顯著（P<0.05）;在同一月齡段，ST肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量高于LD;FTIR分析表明，各月齡段ST和LD肌內(nèi)結(jié)締組織中的Ⅴ型膠原蛋白均出現(xiàn)了主要吸收峰酰胺A、B及酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;ST肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長(zhǎng)而顯著升高（P<0.05），但9、12 月齡間無顯著差異（P>0.05）;LD肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的熱變性溫度隨著月齡的增長(zhǎng)而升高，但9、12 月齡及12、18 月齡間無顯著差異（P>0.05），其他月齡均差異顯著（P<0.05）;氨基酸組成分析結(jié)果表明，Ⅴ型膠原蛋白的總氨基酸、亞氨基酸及羥脯氨酸含量隨著月齡的增長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)，且各月齡間有顯著差異（P<0.05）。本研究解釋了隨著肉羊月齡的增加，其骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的特性變化。

關(guān)鍵詞：烏珠穆沁羊;Ⅴ型膠原蛋白;變性溫度;氨基酸

Abstract： A comparative characterization of the type Ⅴ collagens extracted from the intramuscular connective tissues of Semitendinosus （ST） and Longissimus dorsi （LD） muscles in naturally grazed Ujimqin sheep aged 6， 9， 12 and 18 months was performed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）， Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， thermal denaturation temperature and amino acid composition analysis. The results showed that the type Ⅴ collagens consisted of three different subunits （α1（Ⅴ）， α2（Ⅴ） and α3（Ⅴ））. For both muscles， the content of type Ⅴ collagen was increased significantly （P < 0.05） with age. At each age group， the content of type Ⅴ collagen in ST was higher than in LD. FTIR analysis showed the amide A， B， Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ absorption bands of the type Ⅴ collagens in ST and LD muscles at each age group. The denaturation temperature of type V collagen in ST was significantly increased with age（P < 0.05）， although no significant difference （P > 0.05） was observed between 9- and 12- month-old sheep. The Td of type Ⅴ collagen in LD was increased with age （P > 0.05）， except that there was no significant difference between 9 and?12 months and between 12 and 18 months of age. Amino acid analysis indicated that total amino acid content and imino acid contents （hydroxyproline and proline） were significantly increased with age （P < 0.05）. This study provides a theoretical foundation for explaining the effect of collagen on meat quality.

Keywords： Ujimqin sheep; type Ⅴ collagen; thermal denaturation temperature; amino acidDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190117-015

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）03-0007-07

引文格式：

薛文俊， 曹欣宇， 吳瓊， 等. 不同月齡肉羊肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的特性[J]. 肉類研究， 2019， 33（3）： 7-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190117-015.? ? http：//www.rlyj.net.cn

XUE Wenjun， CAO Xinyu， WU Qiong， et al. Characteristics of type Ⅴ collagens in intramuscular connective tissue from sheep?of different ages[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 7-13. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190117-015.? ? http：//www.rlyj.net.cn

家畜肌肉硬度有固有硬度和尸僵硬度，其中固有硬度主要來自于骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織（intramuscular connective tissue，IMCT）的膠原蛋白[1]。不同品種、甚至同一品種不同年齡階段的家畜肌肉組織中膠原蛋白的含量、熱穩(wěn)定性、膠原蛋白分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)程度等均有很大差距。IMCT的熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性隨動(dòng)物的生長(zhǎng)而增加，這與膠原蛋白分子間共價(jià)交聯(lián)的化學(xué)性質(zhì)和膠原蛋白的氨基酸組成有關(guān)[2]。在幼齡動(dòng)物的結(jié)締組織中，大多數(shù)交聯(lián)以不穩(wěn)定的席夫堿形式存在，對(duì)酸和熱不穩(wěn)定，容易受到膠原蛋白酶和離子強(qiáng)度的變化及溫度的作用而降解[3]。隨著動(dòng)物的生長(zhǎng)，可還原交聯(lián)被轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的非還原交聯(lián)，結(jié)締組織對(duì)酸和熱的敏感性降低，加熱后的膠原蛋白可溶性下降，降低了肌肉的嫩度[4]。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌IMCT中主要有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白，其中含量較多的是Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[5]，因此對(duì)于不同品種骨骼肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的研究較多[6-7]，

但對(duì)于含量較少、提取過程較為復(fù)雜的Ⅴ型膠原蛋白特性的研究報(bào)道較少。Ⅴ型膠原蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白均屬于纖維狀膠原蛋白，纖維狀膠原蛋白的共同結(jié)構(gòu)特征是中心有一個(gè)長(zhǎng)的膠原結(jié)構(gòu)域，含有1 000多個(gè)氨基酸，由Gly-Xaa-Yaa重復(fù)序列組成，其中Xaa和Yaa位置是任一種氨基酸（或亞氨基酸）殘基[8]。當(dāng)Xaa位和Yaa位均為亞氨基酸時(shí)（Gly-Pro-Pro、Gly-Pro-Hyp），膠原蛋白的熱穩(wěn)定性最高[9]。分析膠原蛋白氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，甘氨酸含量最高，其含量隨著來源的不同在28.6%～35.6%之間變化，不含色氨酸，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較高，羥脯氨酸含量是衡量膠原蛋白熱穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，其含量越高，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性越高[10]。本研究采用放牧飼養(yǎng)的不同月齡（6、9、12、18 月）的烏珠穆沁羊，提取半腱?。⊿emitendinosus，ST）和背最長(zhǎng)?。↙ongissimus dorsi，LD）中Ⅴ型膠原蛋白，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)含量、熱變性溫度、氨基酸組成及傅里葉紅外光譜分析，解析骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織Ⅴ型膠原蛋白的特性。這對(duì)膠原蛋白特性與肉品質(zhì)的關(guān)系研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗，選取6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊，所選的各月齡肉羊是同一個(gè)羊群中年齡相同的去勢(shì)公羊，每個(gè)月齡選取6 只羊作為平行。將肉羊屠宰后取半腱肌和背最長(zhǎng)肌，適當(dāng)分割后于液氮中速凍，然后存放于-80 ℃冰箱，冷凍保存?zhèn)溆?。胃蛋白酶?∶10 000）、N-馬來乙酰胺、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、對(duì)二甲基苯甲醛 北京索萊寶科技有限公司;三羥基氨基甲烷（Tris堿）、過硫酸銨（ammonium sulfate，APS）、四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED） 美國(guó)Sigma公司;乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）? ?天津市科盟化工工貿(mào)有限公司;氯胺T 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;L-羥脯氨酸 北京酷來搏科技有限公司;所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XHF-DY高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;CP-100超速離心機(jī)、L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;BG-Power電泳儀 北京白晶生物技術(shù)有限公司;DZ-3335差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 南京大展機(jī)電技術(shù)有限公司;IRAffinity-1傅里葉紅外光譜儀 日本Shimadzu公司;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Ⅴ型膠原蛋白的提取

參考Chandra[11]、永井裕[12]等的方法，并做適當(dāng)調(diào)整。整個(gè)提取過程均在4 ℃條件下進(jìn)行。樣品在4 ℃條件下解凍，稱取150 g骨骼肌組織，剔除肌外膜和脂肪后切碎，加入10 倍量的勻漿液（用5 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的10 g/100 mL NaCl），在3 000 r/min條件下勻漿30 s，此步驟重復(fù)3 次;攪拌之后離心（10 000×g，5 min），去除脂肪等其他組織，取沉淀加入10 倍量的洗凈液（含10 mmol/L EDTA、10 mmol/L?PMSF、12.5 μg/mL N-馬來酰胺），反復(fù)沖洗5 次;10 000×g離心15 min，取沉淀加入胃蛋白酶（胃蛋白酶質(zhì)量∶樣品濕質(zhì)量=1.5∶1），15 ℃消化48 h，100 000×g離心1 h，取上清液，加NaCl至濃度為0.7 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取上清液，加NaCl至濃度為0.5 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的1.0 mol/L NaCl中;100 000×g離心1 h，取上清液，加入NaCl至濃度為4.5 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于0.1 mol/L的Hac，加NaCl至濃度為1.2 mol/L，攪拌過夜;100 000×g離心1 h，取沉淀，沉淀溶解于用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）配制的1.0 mol/L NaCl中，在同一個(gè)緩沖液中進(jìn)行透析，100 000×g離心1 h取沉淀，沉淀即為Ⅴ型膠原蛋白。冷凍干燥后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Ⅴ型膠原蛋白十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析

參考Leammli[13]的方法。采用不連續(xù)Tris-HCl/甘氨酸緩沖系統(tǒng)、8%的分離膠和5%的濃縮膠，稱取一定量的冷凍干燥Ⅴ型膠原蛋白待測(cè)樣，溶解于0.5 mol/L醋酸，與5×上樣緩沖液（1 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，50%丙三醇，β-巰基乙醇，1%溴酚藍(lán)，10% SDS）以4∶1的比例混合，使Ⅴ型膠原蛋白的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，100 ℃水浴5 min;在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后取上清液，抽取15 μL分別加入加樣孔，以同樣的量取Marker加入樣品孔，100 V恒壓電泳，待指示液移到離邊緣約1 cm處，停止電泳;凝膠用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250（含60 mL無水乙醇、14 mL冰乙酸、0.14 g考馬斯亮藍(lán)R-250、60 mL蒸餾水）進(jìn)行染色，染色結(jié)束后在醋酸脫色液（含100 mL無水乙醇、30 mL冰乙酸和270 mL蒸餾水）中進(jìn)行脫色，凝膠成像儀掃描分析。

1.3.3 Ⅴ型膠原蛋白含量的測(cè)定

參考Bergman等[14]的方法，并稍作調(diào)整。準(zhǔn)確稱取冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測(cè)樣30 mg置于具塞試管中，加入6 mol/L HCl，115 ℃水解12 h后加入2 mL氧化劑（含7 g/100 mL氯胺T、74% 26%異丙醇、0.629 mol/L?NaOH、0.14 mol/L檸檬酸、0.453 mol/L乙酸鈉和0.112 mol/L冰乙酸）充分混合，靜置20 min，加入30 mL對(duì)二甲基苯甲醛（將2 g對(duì)二甲基苯甲醛溶解于3 mL 60%高氯酸，與異丙醇按3∶13的比例混合），65 ℃水浴20 min，冷卻后采用紫外分光光度計(jì)于558 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.4 傅里葉紅外光譜檢測(cè)

將2 mg冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測(cè)樣與2 mg KBr混合，研磨成粉并壓制成薄片，置于傅里葉紅外光譜儀內(nèi)，在400～4 000 cm-1頻率范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分辨率為4 cm-1，掃描信號(hào)累加200 次[15]。

1.3.5 Ⅴ型膠原蛋白熱變性溫度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測(cè)樣10 mg，置于鋁坩堝并壓實(shí)密封后以相同質(zhì)量的鋁坩堝為空白組，置于差式掃描熱量?jī)x內(nèi)，在20～150 ℃溫度范圍內(nèi)以1 ℃/min的速率進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.3.6 Ⅴ型膠原蛋白氨基酸組成分析

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[17]。將80 mg冷凍干燥的Ⅴ型膠原蛋白待測(cè)樣置于具塞試管內(nèi)，加入6 mol/L HCl至15 mL，抽真空封管，110 ℃水解24 h后，過濾，定容至50 mL;取1 mL減壓蒸干后，加入0.02 mol/L的鹽酸溶解，利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定膠原蛋白氨基酸組成。實(shí)驗(yàn)條件為：4.6 mm×60 mm分析柱，2622#樹脂;柱溫57 ℃;反應(yīng)溫度135 ℃。其中以檸檬酸-檸檬酸鈉作為緩沖液，以茚三酮作為顯色液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示。2 組間比較采用T-test檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著差異。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，傅里葉紅外光譜圖線采用Origin 7.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE結(jié)果1～4分別為6、9、12、18 月齡ST;5～8分別為6、9、12、18 月齡LD;M為Marker。

由圖1可知，Ⅴ型膠原蛋白條帶清晰，均出現(xiàn)了3 條肽鏈，推測(cè)其亞基組成為α1（Ⅴ）、α2（Ⅴ）、α3（Ⅴ），符合Ⅴ型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征，是Ⅴ型膠原蛋白常見的一種亞型。研究發(fā)現(xiàn)，Ⅴ型膠原是一種含量較少、組織分布廣的纖維型膠原，并且至少有4 種同分異構(gòu)體，包括2α1（Ⅴ）α2（Ⅴ）、α1（Ⅴ）α2（Ⅴ）α3（Ⅴ）、3α3（Ⅴ）、Ⅴ型膠原蛋白α鏈和Ⅺ型膠原蛋白α鏈的混合[18]。不同月齡、不同骨骼肌中Ⅴ型膠原蛋白3 種肽鏈呈現(xiàn)出相同的分子質(zhì)量，條帶及其顏色深淺差別不大。

2.2 骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的含量

大寫字母不同，表示同一肌肉部位、不同月齡間差異顯著（P<0.05）;*. 同一月齡、不同肌肉部位間差異顯著（P<0.05）。圖7同。

由圖2可知：ST和LD肌內(nèi)結(jié)締組織中的Ⅴ型膠原蛋白含量隨著月齡的增長(zhǎng)而增加，且各月齡間差異顯著（P<0.05）;同一月齡，ST肌內(nèi)Ⅴ型膠原蛋白的含量均高于LD;6 月齡和9 月齡ST和LD中肌內(nèi)Ⅴ型膠原蛋白的含量沒有顯著差異（P>0.05），12 月齡和18 月齡時(shí)差異顯著（P<0.05）。研究表明，膠原蛋白的含量受肌肉運(yùn)動(dòng)量的影響，與運(yùn)動(dòng)量較少的肌肉相比，經(jīng)常運(yùn)動(dòng)的肌肉中肌束膜由更多膠原纖維束組成且較發(fā)達(dá)[19]，膠原蛋白含量較高，肌束較粗，肉質(zhì)較硬。各部位肉中所含膠原蛋白的含量不同，其嫩度也不同。Dubost等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，股二頭肌內(nèi)膠原蛋白含量最高，其次是ST和LD。

2.3 Ⅴ型膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

a、b、c、d分別為6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊ST肌內(nèi)結(jié)締組織Ⅴ型膠原蛋白。圖5同。

采用傅里葉紅外光譜分別分析6、9、12、18 月齡烏珠穆沁羊ST和LD肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三股螺旋結(jié)構(gòu)）。由圖3～4可知，各月齡烏珠穆沁羊骨骼肌肌內(nèi)結(jié)締組織中Ⅴ型膠原蛋白的紅外光譜特征基本一致，均具有Ⅴ型膠原蛋白的特征紅外吸收峰。