陳夢青，黃丹,2，孫宇，汪帥，李春梅

(1 廣東藥科大學(xué)，廣州510006；2 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校)

心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心絞痛、心衰等心血管疾病的主要危險因素，但其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚[1～3]。容積調(diào)節(jié)性氯離子通道蛋白3(ClC-3)是電壓門控氯離子通道基因家族成員，在心房和心室細(xì)胞中的含量豐富[4]。我們的前期研究[5]顯示，在兒茶酚胺類物質(zhì)去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞心肌肥厚模型中，ClC-3表達(dá)顯著降低。本研究觀察了腹腔注射NE及其拮抗劑酚妥拉明(Phentolamine，Phe)對小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響，并檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ClC-3及心肌肥厚標(biāo)志物心房鈉尿肽(ANF)的表達(dá)，以探討NE誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 小鼠及主要試劑 C57BL/6小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格編號：SCXK(京)2012-0001，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。NE、Phe購自美國Sigma公司。TRIzol購自TaKaRa生物公司。PCR引物由生工生物工程有限公司設(shè)計并合成，Prime ScriptTMRT Reagent及SYBR PCR Mix購自ToYoBo公司。

1.2 小鼠分組及給藥方法 選取27只六周齡雄性C57BL/6小鼠并隨機(jī)分為NE組、Phe+NE組、對照組，每組9只。NE組小鼠每天腹腔注射NE(2 mg/kg)；Phe+NE組小鼠每天先腹腔注射Phe(8 mg/kg)，2 h后再腹腔注射NE(2 mg/kg)[6,7]；對照組小鼠每天腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 各組小鼠心臟指數(shù)測算及心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 所有藥物連續(xù)注射7 d后，測算各組小鼠心臟指數(shù)并觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。①各組小鼠給藥結(jié)束后禁食1 d，記錄其體質(zhì)量，然后用10%水合氯醛麻醉，用眼科剪及鑷子迅速取出心臟組織，清洗并稱量心臟重量，計算心臟指數(shù)。心臟指數(shù)=心臟重量/體質(zhì)量。②取心肌組織，用4%甲醛液固定，制成石蠟切片，60 ℃烘烤2 h，常規(guī)脫蠟，HE染色，脫水，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 各組小鼠心肌組織中ClC-3和ANF mRNA的檢測 取各組小鼠心肌組織，冰上剪碎，用預(yù)冷PBS清洗至上清澄清，TRIzol法提取心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，Real-time PCR法檢測心肌組織ClC-3和ANF mRNA的相對表達(dá)量。引物序列如下：ClC-3上游引物5′-CCCGAGGTGGAGAGAGACTGCT-3′,下游引物為5′-CCGGCTTTCAGAGAGGTTACG-3′；ANF上游引物為5′- TAGGAGACAGTGACGGACAA-3′,下游引物為5′-GAAGAAGCCCAGGGTGAT-3′； GAPDH上游引物為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA -3′,下游引物為5′-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3′。PCR反應(yīng)體系：SYBR MIX 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 各組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的檢測 采用Western blotting法。取各組小鼠心肌組織，冰上剪碎，用預(yù)冷的PBS清洗至上清澄清，按50 mg/mL加入裂解液，冰上勻漿后4 ℃、12 000 r/min離心12 min，取上清，BCA法定量。制備10% SDS-PAG，電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液浸泡1 min后，以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測各組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的相對表達(dá)量。ClC-3蛋白的相對表達(dá)量=ClC-3蛋白的平均光密度值/GAPDH蛋白的平均光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟指數(shù)比較及心肌組織形態(tài)學(xué)變化 ①NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心臟指數(shù)分別為5.22±0.46、4.80±0.23、4.61±0.25，NE組與Phe+NE組、對照組相比，P均<0.05。②NE組小鼠心肌細(xì)胞和心肌肌束排列異常，心肌細(xì)胞及細(xì)胞核異常肥大、變形，細(xì)胞核聚集，出現(xiàn)明顯的心臟重構(gòu)、心肌細(xì)胞增大現(xiàn)象，提示小鼠出現(xiàn)心肌肥厚；Phe+NE組、對照組小鼠心肌細(xì)胞正常，心肌細(xì)胞排列有序，無核聚集現(xiàn)象，見圖1。

2.2 各組小鼠心肌組織中ClC-3和ANF mRNA的表達(dá)比較 NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ClC-3 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.50±0.10、1.16±0.38、1.00±0.00，NE組與Phe+NE組、對照組相比，P均<0.01。NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ANF mRNA的相對表達(dá)量分別為2.95±1.78、1.96±0.75、1.00±0.00，NE組與Phe+NE組、對照組相比，P均<0.05。

2.3 各組小鼠心肌組織ClC-3蛋白的表達(dá)比較 NE組、Phe+NE組、對照組小鼠心肌組織中ClC-3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.46±0.02、0.68±0.02、0.69±0.04，NE組與Phe+NE組、對照組相比，P均<0.05。

3 討論

心肌肥厚是威脅人類健康的常見疾病，主要的病理變化表現(xiàn)為心肌重構(gòu)，包括心臟重量增加、心肌細(xì)胞體積增大、心臟成纖維細(xì)胞增殖、心間質(zhì)纖維化和ANF、腦鈉肽、β-肌球蛋白重鏈等心肌肥厚標(biāo)志物的升高[8]。心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，人們對心肌肥厚發(fā)生的確切分子機(jī)制仍不清楚。研究[9]顯示，誘導(dǎo)心肌肥厚發(fā)生的因素有很多，兒茶酚胺、機(jī)械性因素、神經(jīng)體液、細(xì)胞因子、血流動力學(xué)等因素都能誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生。研究[10]表明，NE刺激可導(dǎo)致大鼠心肌肥厚和纖維化的發(fā)生。NE作為交感神經(jīng)末梢釋放的重要遞質(zhì)，可通過α-腎上腺素能受體介導(dǎo)心肌肥厚及ANF的表達(dá)升高。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠連續(xù)腹腔注射NE 7 d后心臟指數(shù)顯著升高，組織形態(tài)學(xué)觀察顯示小鼠出現(xiàn)明顯的心臟重構(gòu)、心肌細(xì)胞增大現(xiàn)象，且心肌肥厚標(biāo)志物ANF mRNA顯著升高，而NE拮抗劑Phe的加入能明顯改善這一現(xiàn)象。

研究[11]表明，容積調(diào)節(jié)性氯離子通道參與了心肌細(xì)胞容積調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡，對缺血的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。ClC-3是容積調(diào)節(jié)性氯離子通道基因家族成員之一，在各類動物體內(nèi)廣泛表達(dá)。研究[4]表明，ClC-3可以通過容積調(diào)節(jié)性氯離子電流參與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性、細(xì)胞遷移、細(xì)胞器酸化、細(xì)胞的增殖與分化等。Xiong等[12]發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠心臟ClC-3基因會誘導(dǎo)心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，提示ClC-3與心肌肥厚的發(fā)生有一定關(guān)系。另外，在擴(kuò)張型心肌病的犬和主動脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠中，均發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)性氯離子電流持續(xù)激活。因此，我們課題組前期進(jìn)行了細(xì)胞研究[5]，發(fā)現(xiàn)在NE誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞中，ClC-3的表達(dá)明顯降低?，F(xiàn)進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)注射NE 7 d后，NE組小鼠心肌細(xì)胞和心肌肌束排列異常，心肌細(xì)胞及細(xì)胞核異常肥大、變形，細(xì)胞核聚集，出現(xiàn)明顯的心臟重構(gòu)、心肌細(xì)胞增大現(xiàn)象，提示NE可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)心肌肥厚。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NE組小鼠心肌組織中ClC-3 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低，而Phe能拮抗此作用，進(jìn)一步驗(yàn)證ClC-3的降低與NE誘導(dǎo)的心肌肥厚有一定的關(guān)系。

綜上所述，NE可誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚，其機(jī)制可能與其抑制ClC-3 mRNA和蛋白的表達(dá)有關(guān)。