魯 陳，胡 賀，杜方超，劉發(fā)庭，邵 云，局文靜

（南京福潤德動(dòng)物藥業(yè)有限公司，南京 210000）

銅是動(dòng)物必需的微量元素，自從Braude等1945年發(fā)現(xiàn)銅對豬有促生長作用以來，一系列的試驗(yàn)證明飼喂高出需要量的高銅日糧，可促進(jìn)豬的生長，較為經(jīng)濟(jì)有效的飼喂量是110～250 mg·kg-1[1-3]。目前高銅的來源主要是無機(jī)硫酸銅，因?yàn)槠鋬r(jià)格便宜。但是豬對其吸收率低，導(dǎo)致糞尿銅排泄多，對環(huán)境污染嚴(yán)重。基于此，國家農(nóng)業(yè)部2009年對飼糧中銅含量進(jìn)行了限量規(guī)定，限定銅的最高添加量斷奶仔豬銅為200 mg·kg-1，生長肥育豬為150 mg·kg-1，盡量降低殘留和對環(huán)境的污染。與此同時(shí)，低殘留的有機(jī)銅飼料添加劑先后被開發(fā)出來，如堿式氯化銅、氨基酸螯合銅、殼聚糖銅銅和酵母銅等，但是這些有機(jī)銅源生產(chǎn)成本高[4-7]。因此，研發(fā)既高效又經(jīng)濟(jì)的飼用有機(jī)銅添加劑，對促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究發(fā)現(xiàn)，微生物能富集轉(zhuǎn)化無機(jī)銅為微生物有機(jī)銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，微生物有機(jī)銅如酵母銅，受到人們的青睞，不過，這類高銅菌的篩選主要是利用傳統(tǒng)的飼用微生物作為資源進(jìn)行馴化，通過長時(shí)間銅誘導(dǎo)培養(yǎng)來獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩(wěn)定性差，易退化，富銅能力也會隨之下降。為此，本研究綜述富銅土壤中能將無機(jī)銅轉(zhuǎn)化為微生物有機(jī)銅的高效菌株，為養(yǎng)豬生產(chǎn)中高效廉價(jià)的新型有機(jī)銅添加劑的使用提供借鑒。

1 微生物銅

1.1 微生物銅的概念

微生物富集吸收無機(jī)銅元素，通過微生物的生長代謝轉(zhuǎn)化無機(jī)銅為微生物銅，其是由對人或動(dòng)物有利的益生菌發(fā)酵生產(chǎn)得到的制劑，其活性成分主要為微生物菌體。其飼喂效果主要表現(xiàn)促進(jìn)機(jī)體的消化吸收，降低銅的排放、提升機(jī)體免疫能力及增進(jìn)動(dòng)物生長性能等[8]。

1.2 飼料銅添加劑的發(fā)展?fàn)顩r以及存在的問題

銅元素是豬生長所必需的微量元素之一，是一種維持豬生長發(fā)育和生命活動(dòng)的必需營養(yǎng)物質(zhì)，是豬的健康和高效生產(chǎn)不可或缺的必需微量元素。為促進(jìn)豬的生長發(fā)育，改善肉品質(zhì)，提高豬對飼料的利用率，自20世紀(jì)90年代以來，銅元素被廣泛運(yùn)用在養(yǎng)豬生產(chǎn)中。銅通過刺激促生長激素及相關(guān)因子（如胰島素樣生長因子-1）的合成與分泌，促進(jìn)體蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)豬的生長。在日糧中添加高銅，通過血-腦屏障在腦中積累，使腦銅含量增加，增加豬垂體生長激素mRNA（GH mRNA）濃度，增加血清中生長激素（GH）濃度，進(jìn)而促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積和骨骼生長[9]。硫酸銅100～300 mg·kg-1日糧飼喂仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著銅濃度增加組仔豬平均日增重（ADG）、料重比（F/G）、飼料攝入量和GH、胰島素（INS）、類胰島素一號增長因子（IGF-Ⅰ）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3（IGFBP-3）顯著增加（P＜0.01）；銅含量250 mg·kg-1時(shí)，仔豬ADG顯著增加（P＜0.01），從而促進(jìn)斷奶仔豬的生長發(fā)育[5]。飼喂高銅日糧可增加豬的采食量，使平均日采食量提高9.91%，粗脂肪的表觀消化率提高10.01%，增加血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，提高淀粉酶的活性，提高豬免疫力[10]。使仔豬ADG提高23.24%，F(xiàn)/G 12.78%；提高Ca和P消化率[11]。給20～100 kg育肥豬飼喂高銅，ADG提高3.3%、料肉比降低1.5%，使背膘厚降低4.7%,眼肌面積提高17.0%[12]。妊娠期和哺乳期母豬飼喂高銅日糧也可使仔豬出生重提高8%，斷奶重提高5%[13]。然而在豬采食高銅過后，只有＜10%的銅被吸收利用并在機(jī)體中沉積，其余都隨著糞便排出體外，這些排出的銅又是不可降解的物質(zhì)，并且還會對土壤和水體造成嚴(yán)重污染[14-18]。這樣，飼喂高銅飼糧不僅會對銅造成大量浪費(fèi)，而且還會對地球上原有的生物鏈造成嚴(yán)重的破壞[19]。在農(nóng)田中施放含高銅的豬糞有機(jī)肥會導(dǎo)致植物體內(nèi)銅濃度的增加，不僅會導(dǎo)致農(nóng)作物生長變慢、產(chǎn)量降低，還能影響農(nóng)作物對其他營養(yǎng)元素吸收利用。植物在整個(gè)自然界的食物鏈中位于第一級營養(yǎng)水平，因此會通過食物鏈傳遞對整個(gè)自然界都會產(chǎn)生影響。當(dāng)長期在牧草地中大量施用含有高銅的有機(jī)糞時(shí)，牧草中銅含量達(dá)到15～20 mg·kg-1時(shí)，綿羊采食過后就可能造成中毒，食物鏈源頭發(fā)生的變化在生物鏈的傳遞中具有生態(tài)放大作用[20]。豬糞有機(jī)肥中銅含量的增加會對植物生長產(chǎn)生不良影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著有機(jī)肥中銅含量的增加，玉米葉片凈光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、光合色素含量顯著降低（P＜0.05）；玉米葉片可溶性蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸總量顯著降低（P＜0.05），玉米的生長性能和營養(yǎng)成分含量降低[21-22]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中使用微量元素銅不僅要考慮其帶來的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)還要考慮其可能會給環(huán)境帶來的污染[5]。

2 微量元素銅對動(dòng)物機(jī)體影響

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)銅主要分布于肝臟、腎臟、腦、心臟以及毛發(fā)中，其中肝臟不僅是銅重要的貯存庫，同時(shí)也是銅代謝的重要器官。銅在動(dòng)物體內(nèi)主要以與白蛋白結(jié)合的形式存在，在血漿中結(jié)合成血漿銅藍(lán)蛋白，紅細(xì)胞中結(jié)合成紅細(xì)胞銅藍(lán)蛋白，剩下的銅可以與蛋白質(zhì)結(jié)合后形成肝臟銅蛋白、心肌銅蛋白等。銅對畜禽健康的影響見附表。

附表 銅對畜禽健康的影響

3 銅在機(jī)體內(nèi)的消化吸收

動(dòng)物消化道各段都能吸收銅，但最主要的吸收部位是胃、小腸和十二指腸。銅在被小腸上皮細(xì)胞吸收后，通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，然后被肝細(xì)胞吸收并合成銅藍(lán)蛋白，而多余的未吸收的部分則排入膽汁，分泌后進(jìn)入十二指腸。小腸上皮細(xì)胞對銅的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)是動(dòng)物完成銅生物利用的最關(guān)鍵的步驟，在轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中，銅的形態(tài)會產(chǎn)生變化。仔畜對日糧中銅的吸收率為15%～30%，成年動(dòng)物為5%～10%[23]。當(dāng)飼糧中添加的銅濃度低時(shí)，銅主要通過易化擴(kuò)散的方式被吸收利用；當(dāng)飼糧中銅濃度高時(shí)，可通過簡單擴(kuò)散被吸收利用。在對銅絡(luò)合物的形態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，羧基、羥基、巰基等多種基團(tuán)都能與銅發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，具體的發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的方式不僅與該基團(tuán)在配體中的分布有關(guān)，還與配體的空間位阻、環(huán)境中的pH以及配體的濃度等因素有關(guān)[24]。采用銅離子選擇電極法測定pH 2～6時(shí)銅的電勢變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH為2時(shí)，大部分銅都以離子態(tài)的形式存在，當(dāng)pH升至3時(shí)，銅會與酒石酸、蘋果酸和檸檬酸產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)，pH 3.5時(shí)，與天冬氨酸會發(fā)生絡(luò)合；pH 4.1時(shí)與乳清蛋白也會發(fā)生反應(yīng)；隨著pH上升，銅的電勢會迅速下降[25]。由此可推測銅在胃中主要以離子態(tài)存在，在腸道中主要以絡(luò)合物存在。

有機(jī)銅與無機(jī)銅（硫酸銅）在細(xì)胞中的透過率及細(xì)胞本身對銅的吸收率中也存在區(qū)別。利用細(xì)胞制成銅的吸收模型，通過分別對硫酸銅、賴氨酸螯合銅、谷氨酸螯合銅等不同形態(tài)銅的細(xì)胞透過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)螯合銅的細(xì)胞透過率遠(yuǎn)高于硫酸銅。目前關(guān)于有機(jī)絡(luò)合銅和無機(jī)銅的生物利用率的差異存在兩種假說。一種是競爭吸收假說，認(rèn)為絡(luò)（螯）合態(tài)微量元素的配體可對其中心的金屬離子形成一種保護(hù)，防止微量元素在到達(dá)吸收位點(diǎn)之前就被抗?fàn)I養(yǎng)因子結(jié)合或者形成不溶性的物質(zhì)；另一種則是完整吸收假說,認(rèn)為氨基酸絡(luò)（螯）合礦物質(zhì)是直接以肽或氨基酸的吸收機(jī)制被完整吸收。

4 不同類型銅添加劑在豬生產(chǎn)中的研究進(jìn)展

4.1 飼料銅類型對豬生產(chǎn)性能的影響

目前飼料添加的無機(jī)銅主要為硫酸銅、納米銅等，有機(jī)銅主要有蛋白螯合銅、氨基酸螯合銅、堿式氯化銅、殼聚糖銅、螺旋藻銅和酵母銅等。大量試驗(yàn)表明，將有機(jī)銅替代無機(jī)銅飼喂動(dòng)物發(fā)現(xiàn)其對動(dòng)物的生長沒有影響，且能降低糞便中銅的排放量，并能提高銅的生物利用率[26-27]。

銅添加劑的顆粒大小對豬生長也存在影響，日糧中添加納米銅50 mg·kg-1飼喂豬與硫酸銅飼喂豬相比，納米銅能改善豬的生產(chǎn)性能，提高銅的利用率，降低糞銅含量。

銅添加劑的類型對仔豬生長也存在影響，飼料中添加羥基氯化銅（150 mg·kg-1）能較硫酸銅顯著提高豬的ADG和末重，降低仔豬腹瀉率[28]。Guo等用0～160 mg·kg-1蛋白銅和堿式氯化銅（TBCC）飼喂仔豬發(fā)現(xiàn)，添加蛋白銅40或80 mg·kg-1能顯著增加豬的ADG，添加蛋白銅80 mg·kg-1與添加TBCC 160 mg·kg-1相比，糞銅排放量降低50%，且對豬的生產(chǎn)性能和健康無不良影響[4]。氨基酸螯合銅對仔豬的生長也具有積極作用，如在飼料中添加硫酸銅160 mg·kg-1和N-氨甲酰谷氨酸螯銅，N-氨甲酰谷氨酸螯銅能夠促進(jìn)仔豬增長，提高F/G和降低糞銅排放量；蛋氨酸銅可提高仔豬ADG和飼料的利用率，提高F/G；甘氨酸銅增加仔豬ADFI、降低料肉比[29-31]。小肽螯合銅飼喂仔豬，也能顯著增加仔豬的ADG，降低糞銅排放[32]。殼聚糖銅100 mg·kg-1、硫酸銅100 mg·kg-1、殼聚糖銅100 mg·kg-1+硫酸銅飼料和無銅日糧飼喂仔豬，飼喂殼聚糖銅仔豬ADG高、腹瀉發(fā)病低；十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比均高于其他組；回腸上皮細(xì)胞凋亡顯著減少；抗氧化酶活性顯著高于其他組[5]。用富銅螺旋藻代替硫酸銅飼喂仔豬，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)富銅螺旋藻能使低密度脂蛋白膽固醇降低17.05%（P＜0.05），總膽固醇下降9.43%（P＜0.05）[33]。

不同銅添加劑類型對生長肥育豬的影響不同。飼喂硫酸銅75 mg·kg-1和TBCC 150 mg·kg-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)試驗(yàn)期飼喂硫酸銅和TBCC都能提高平均日采食量（ADFI）、降低了G/F；隨著銅添加量的添加，ADG、末重、ADFI和瘦肉率也顯著增加[34]。對飼喂硫酸銅4、160 mg·kg-1和蛋氨酸螯合銅20～160 mg·kg-1，發(fā)現(xiàn)飼喂蛋氨酸螯合銅80 mg·kg-1能顯著增加豬的ADG和飼料轉(zhuǎn)化率；與硫酸銅160 mg·kg-1組相比，豬的末重增加1.8 kg，胴體重增加2.3 kg[35]。小肽螯合銅代替硫酸銅飼喂肥育豬，對生產(chǎn)性能和健康狀況無不良影響，且能顯著降低糞銅的排放量[36]。從以上研究來看，各種形式的高銅都對豬的生長具有顯著影響，提高豬的生長性能，但有機(jī)銅的生物利用度要高于無機(jī)銅，不僅有效降低了豬糞中的銅含量，還可以節(jié)約礦物資源，降低環(huán)境污染。

4.2 飼料銅類型對豬免疫性能的影響

銅在維持豬免疫功能中起重要作用，其不足或過量攝入會損害豬的免疫細(xì)胞數(shù)量和功能[37]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銅的促生長作與它的抗菌作用有關(guān)，而高銅的促生長作用也與其抗菌作用有關(guān)[38-39]。斷奶是仔豬生長的一個(gè)重要階段，斷奶后3～4 d是仔豬腹瀉的潛伏期，1周后可達(dá)到高峰，可能是通過食物狀態(tài)、營養(yǎng)成分、生理狀態(tài)或環(huán)境條件的改變，而引起腸道菌群的變化，使得消化道內(nèi)菌群失調(diào)，腸道內(nèi)pH升高，病原菌大量繁殖，從而導(dǎo)致仔豬下痢[40]。銅在胃腸道內(nèi)可發(fā)揮著類抗生素的作用，如載銅氨基多糖納米微?？娠@著降低盲腸中總需氧菌、總厭氧菌、沙門氏菌和大腸桿菌等有害菌的數(shù)量，而顯著增加乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量；殼聚糖銅能顯著降低腸道內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，促進(jìn)乳酸桿菌的增殖[41]。缺銅可降低白細(xì)胞介素2水平和T細(xì)胞增殖[42]。

對斷奶仔豬飼喂不同劑量的載銅納米殼聚糖（CNP-Cu），結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬血清中免疫球蛋白存在不同程度的提高；與對照組（硫酸銅：10 mg·kg-1）相比，飼喂CNP-Cu的能顯著提高仔豬血清補(bǔ)體C3水平（P＜0.05）；飼喂100 mg·kg-1劑量豬血清溶菌酶含量最高，提高28.70%（P＜0.05）[43]。飼喂檸檬酸銅20 mg·kg-1可使仔豬的腹瀉發(fā)生率降低71.57%，血清溶菌酶濃度升高170.73%（P＜0.05）[44]。蛋白質(zhì)螯合銅按30%或100%替代硫酸銅飼喂生長肥育發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)螯合銅能提高豬免疫器官指數(shù)；完全替代硫酸銅飼喂能顯著提高淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量以及紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度等血常規(guī)指標(biāo)（P＜0.05），且完全替代，血紅蛋白濃度顯著高于30%替代（P＜0.05）；完全替代顯著提高了十二指腸、空腸的淋巴細(xì)胞數(shù)量，且十二指腸淋巴細(xì)胞數(shù)量高于30%替代（P＜0.05）[45]。

4.3 飼料銅類型對豬抗氧化性能的影響

銅是血漿銅藍(lán)蛋白和銅鋅超氧化物岐化酶的組成成分，其參與機(jī)體的抗氧化反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)的超氧離子和自由基[46]。

研究發(fā)現(xiàn)，小肽螯合銅代替無機(jī)硫酸銅飼喂肥育豬，可顯著降低蛋白質(zhì)羰基濃度顯著降低（P＜0.05）；降低堿性磷酸酶（AKP）活性（P=0.05）；顯著降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性（P＜0.05）[36]。飼料中添加CNP-Cu能改善斷奶仔豬抗氧化能力，通過顯著提高血清谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和血清總抗氧化能力（T-AOC）來提高仔豬的抗氧化能力[47]。對仔豬飼喂檸檬酸銅30、60、120和240 mg·kg-1發(fā)現(xiàn)，隨著銅濃度增加，顯著降低血清中血清丙二醛（MDA）濃度（P＜0.05）和谷胱甘肽過氧化物酶的活性（P＜0.01）；增加血清銅鋅超氧化物歧化酶（SOD，P＜0.01）；降低肝組織中MDA的濃度（P＜0.01）；增加血清高密度脂蛋白的濃度（P＜0.01）[48]。日糧中添加CuSO4100%、蛋白螯合銅30%和蛋白螯合銅100%飼喂豬，結(jié)果表明，蛋白螯合銅讓豬脾臟中SOD的活性分別提高14.80%和17.40%（P＜0.05），且能顯著降低脾臟MDA的含量（P＜0.05），飼喂蛋白螯合銅100%還可降低豬肝臟MDA含量（P＜0.05）[49]。

5 微生物銅

隨著國家環(huán)境保護(hù)力度的不斷加大，低殘留的有機(jī)銅飼料添加劑先后被開發(fā)出來，如羥基氯化銅、氨基酸螯合銅、殼聚糖銅銅等，這些有機(jī)銅具有水溶性強(qiáng)、易消化吸收等優(yōu)點(diǎn)[5,23,50]。但是這些有機(jī)銅源生產(chǎn)成本高[51]。因此，研發(fā)既高效又經(jīng)濟(jì)的飼用有機(jī)銅添加劑，對促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物能富集轉(zhuǎn)化無機(jī)銅為微生物有機(jī)銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)[7]。自然環(huán)境中微生物種類多且繁殖速度快，并且能夠在各類污染物存在的不良環(huán)境中適應(yīng)并生長，對土壤中的重金屬具有較強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化和生物吸附作用[52]。細(xì)菌、真菌都有耐銅作用，且大多存在于銅礦廢棄地等高銅污染的土壤中，具有分布廣泛、種類繁多、表面積大、帶電、繁殖快速和代謝旺盛等特點(diǎn)，在生長過程中會不斷向體外分泌小分子有機(jī)酸、無機(jī)酸和代謝中間產(chǎn)物，并可以通過對重金屬的吸附富集、氧化還原、成礦沉淀和協(xié)同植物吸收等作用來完成對銅吸附代謝去除[53-55]。

通過細(xì)菌的吸附動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌USTB-F對銅具有較強(qiáng)的吸附和富集能力，且吸附的銅離子84.97%分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，對銅的最高耐受濃度可達(dá)560 mg·L-1[56]。在高酸性廢水中，銅濃度10 mg·L-1，硫酸還原菌對銅的去除達(dá)99.9%[57]。克雷伯氏桿菌在強(qiáng)酸條件對銅也具有較強(qiáng)的去除能力，銅濃度100 mg·L-1，pH 3時(shí)，去除率達(dá)到59.7%，通過吸附模型發(fā)現(xiàn)，吸附的銅離子有92.3%分布在細(xì)胞壁上，其余7.7%分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[58]。黑曲霉對銅也具有很強(qiáng)的吸附能力，Cu濃度為200 mg·L-1時(shí)，黑曲霉TLSF2對Cu的吸附量最大，達(dá)17.76 mg·g-1。利用紅外光譜檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁富集銅的主要部位，主要通過羧基、氨基和羥基來吸附[59]。

目前微生物富銅大多用于環(huán)境的凈化研究，而做為飼料的微生物銅主要研究為酵母銅[60]。利用酵母菌對銅富集得到酵母銅，除其本身富集有高含量的銅元素外可提供酵母銅外，酵母菌本身還可提供大量的菌體蛋白、多肽、小肽、氨基酸、豐富的B族維生素、消化酶以及其他生物活性物質(zhì)。其細(xì)胞壁還含有甘露寡糖，對動(dòng)物的健康也具有重要作用。對釀酒酵母的富銅研究發(fā)現(xiàn)，在銅濃度1.5 mg·mL-1的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，菌體中銅含量可達(dá)11.74 mg·g-1[61]。此外，酵母銅具有良好的穩(wěn)定性，與日糧中其他組分配伍性好、吸收率高、排泄率低并對對環(huán)境污染小。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與硫酸銅相比，酵母銅能顯著提高肉雞肝臟、胰臟和腎臟銅濃度，說明酵母銅具有較高的利用率。日糧中添加50 mg·kg-1酵母銅，在提高仔豬的生長性能和抗氧化酶活性方面與添加250 mg·kg-1硫酸銅作用效果相似，都能顯著增加血清中CuZn-SOD和銅蘭蛋白的活性[62]。酵母銅還能提高肝臟鐵和鋅的濃度，能有效促進(jìn)鐵和鋅的利用率[63]。

6 展望

目前飼料中的微生物銅主要為酵母銅，酵母銅的篩選主要是利用傳統(tǒng)的飼用微生物作為資源進(jìn)行馴化，通過長時(shí)間銅誘導(dǎo)培養(yǎng)來獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩(wěn)定性差，易退化，富銅能力也會隨之下降。因此，應(yīng)對飼用微生物富集銅繼續(xù)進(jìn)行研究，以期為提供高效廉價(jià)、穩(wěn)定、含銅高的微生物銅提供生產(chǎn)提供理論依據(jù)。