宋昌霞，魏克強(qiáng)

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

近年來(lái)，我國(guó)水域環(huán)境的污染狀況日益嚴(yán)峻，重金屬鎘是典型的污染物之一，能對(duì)水生動(dòng)物造成氧化應(yīng)激、免疫損傷等毒性效應(yīng)，嚴(yán)重危害了水生動(dòng)物健康[1-4]?？耸显r（Procambarus clarkii）是我國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，還是一種潛在的水質(zhì)環(huán)境污染的指示生物[5]。肝胰腺是甲殼動(dòng)物重要的免疫和解毒器官[6-7]。研究表明，NF-κB 是進(jìn)化保守的氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員p65（RelA）在天然免疫反應(yīng)中具有重要作用[8]。目前還發(fā)現(xiàn)，在甲殼動(dòng)物等低等無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)也存在該蛋白的類(lèi)似物，其mRNA 主要在肝胰腺表達(dá)和分布[9]。

本研究以亞致死濃度的Cd2+為脅迫因子，利用免疫組化法（IHC）分析了不同濃度Cd2+對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺NF-κB p65 表達(dá)的影響，旨在為甲殼動(dòng)物的免疫毒理學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

健康克氏原螯蝦（體長(zhǎng)為（9±0.5）cm，體質(zhì)量為（21.2±4.2）g），購(gòu)于太原市五龍口水產(chǎn)市場(chǎng)。試驗(yàn)前于曝氣充足的玻璃缸中暫養(yǎng)7 d，水溫為（16±1）℃，pH 值為 6.5±0.2，試驗(yàn)前 24 h 不再喂食。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有多聚甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木素、伊紅、氨水、中性樹(shù)膠、檸檬酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；NF-κB p65 多克隆抗體（Proteintech，武漢），兔IgG SABC 免疫組化試劑盒（博士德，武漢），DAB 試劑盒（索萊寶，北京）。

儀器主要有石蠟切片機(jī)（Leica RM2255，德國(guó)），CO2恒溫培養(yǎng)箱（HH.CP-7 型，上海），光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，日本）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 染毒與取樣 采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法。確定 96 h 半致死濃度（LC50≈42 mg/L）后，隨機(jī)分為3 個(gè)處理組：健康對(duì)照組和1.0，5.0 mg/L Cd2+染毒組，每組6 只。染毒96 h 后，隨機(jī)取3 尾，置于冰上麻醉，解剖取肝胰腺組織，4%多聚甲醛固定48 h。

1.3.2 肝胰腺組織H.E.染色 其參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行。將固定的肝胰腺組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm），蘇木素、伊紅染色后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 免疫組化法檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[11-12]的方法，石蠟切片常規(guī)脫蠟，免疫組化三步法（SABC 法）檢測(cè) NF-κB p65 的表達(dá)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察拍照。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，使用Image-ProPlus 6.0 軟件讀取每個(gè)視野下陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)區(qū)域的平均光密度值（MOD）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織切片病理觀察

H.E.染色顯示，健康螯蝦的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，由肝小管及上皮細(xì)胞組成，主要為B 細(xì)胞（存儲(chǔ)細(xì)胞）和R 細(xì)胞（分泌細(xì)胞）；在Cd2+脅迫下，肝胰腺組織破損，肝小管官腔變窄，R 細(xì)胞排列紊亂、少量B 細(xì)胞破裂（圖1-A）。

2.2 肝胰腺組織的NF-κB p65表達(dá)

免疫組化分析表明，正常狀況下，NF-κB p65主要在B 細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)且維持在較低的水平。Cd2+脅迫下，其表達(dá)水平分別是對(duì)照的6 倍和12 倍（P＜0.01），且 5 mg/L 組與 1 mg/L 組間差異顯著（P＜0.01）（圖1-B～E）。

3 結(jié)論與討論

核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 由 NF-κB/Rel 蛋白家族構(gòu)成，通常多以p65 和p50 的異二聚體形式存在。一般情況下，NF-κB 處于非活化狀態(tài)，與抑制蛋白IκB 結(jié)合處于胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞被刺激后，會(huì)使 IκB 發(fā)生磷酸化，從而與NF-κB 脫離，p65 從細(xì)胞質(zhì)中遷移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控免疫有關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[13-15]。

肝胰腺是甲殼動(dòng)物主要的解毒器官，也是重金屬Cd2+蓄積的主要組織[16]。毒性Cd2+導(dǎo)致超氧陰離子、羥自由基和過(guò)氧化氫等活性氧自由基（ROS）的產(chǎn)生增多，激活氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子[17]。一些研究表明，NF-κB 是 ROS 的主要靶點(diǎn)[18-20]。本研究的結(jié)果顯示，Cd2+暴露能夠?qū)е赂我认俳M織的NF-κB p65 蛋白含量顯著升高（P＜0.01）；低質(zhì)量濃度Cd2+處理的表達(dá)量明顯低于高質(zhì)量濃度處理，這可能由于在低質(zhì)量濃度的Cd2+暴露后，機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量ROS，通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)清除了部分ROS。而在高質(zhì)量濃度Cd2+暴露后，機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量ROS無(wú)法通過(guò)自身清除，進(jìn)一步激活NF-κB 信號(hào)通路，使NF-κB p65 蛋白大量表達(dá)。譚樹(shù)華等[6]研究了鎘對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化系統(tǒng)的影響，也表明了類(lèi)似的規(guī)律，即低濃度鎘脅迫下典型抗氧化酶活力增加，高濃度暴露則對(duì)機(jī)體造成抗氧化防御系統(tǒng)的損傷。這提示，細(xì)胞NF-κB p65 的表達(dá)與胞內(nèi)的ROS 水平密切相關(guān)，這可能是水體重金屬鎘暴露導(dǎo)致甲殼動(dòng)物的毒性效應(yīng)之一，其如何影響螯蝦的細(xì)胞免疫、體液免疫，還需進(jìn)一步深入研究。