吳建紹，李雷斌，朱志煌，鐘建興，蘇國強(qiáng)，周 宸，林克冰，方民杰

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013 )

雙斑東方鲀(Takifugubimaculatus)屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬，為近海暖溫性魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，營養(yǎng)價值高，被譽(yù)為“魚中之王”，深受消費(fèi)者喜愛。目前雙斑東方鲀作為福建當(dāng)?shù)靥厣贩N在全省規(guī)模化養(yǎng)殖，并廣泛用于魚、蝦、貝生態(tài)高值化混養(yǎng)。我國對雙斑東方鲀已開展了生物學(xué)特性[1]、人工繁育[2-3]、雜交育種[4]、養(yǎng)殖模式[5-6]和河鲀毒性毒素[7-10]等方面的研究，而關(guān)于雙斑東方鲀的病害防治研究較少,有待學(xué)者深入研究探討。

刺激隱核蟲病，又名“海水小瓜蟲病”，是由刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)引起的流行廣泛、危害嚴(yán)重的魚類致死性寄生蟲病[11-14]。刺激隱核蟲可感染多種海水硬骨魚類，發(fā)病時體表、鰭條和鰓絲易形成肉眼可見的白點(diǎn)，俗稱“白點(diǎn)病”；該病傳染速度快，如不及時采取措施，可導(dǎo)致感染的魚類大面積死亡[15-16]；2008年12月農(nóng)業(yè)部第1125號公告將其列為國家二類動物疫病。雙斑東方鲀規(guī)?；B(yǎng)殖過程中常伴有刺激隱核蟲病發(fā)生[17]，發(fā)病時防治不當(dāng)，易造成大量魚死亡。

硫酸銅具有較好驅(qū)殺刺激隱核蟲作用[18-20]，但有關(guān)硫酸銅用于雙斑東方鲀病害防治研究未見詳細(xì)報道。本研究開展了常用藥物硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚急性毒性試驗(yàn)及對刺激隱核蟲病治療試驗(yàn)，評價了硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚的毒性效應(yīng)，確認(rèn)了硫酸銅對雙斑東方鲀的安全質(zhì)量濃度及對刺激隱核蟲病治療的質(zhì)量濃度，為雙斑東方鲀養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中防治刺激隱核蟲病提供了科學(xué)研究依據(jù)，也為其他經(jīng)濟(jì)魚類防控刺激隱核蟲病提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)魚

1.1.1 試驗(yàn)材料與儀器

Multi-3430多參數(shù)水質(zhì)檢測儀、Lw200-20T光學(xué)顯微鏡、Canon-IXUS相機(jī)、聚乙烯塑料桶、黑色玻璃鋼桶。藥物：五水硫酸銅(分析純)，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 急性毒性試驗(yàn)魚

急性毒性試驗(yàn)幼魚來源于福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地繁育的雙斑東方鲀，魚無傷病、反應(yīng)靈敏、規(guī)格相近且健壯，體長(3.51±0.20) cm、體質(zhì)量(1.18±0.26) g。

1.1.3 患病的試驗(yàn)魚

患病的試驗(yàn)魚來自中試基地繁育的雙斑東方鲀，體長(8.18±0.91) cm，體質(zhì)量(13.08±4.44) g。

病魚外觀癥狀：體表、鰭條有肉眼可見的“白點(diǎn)”，體表黏液多，少數(shù)病魚游動異常。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

參照《水生生物毒性試驗(yàn)方法》[21]進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)確定正式試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍，在正式試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)按等對數(shù)間距法設(shè)置5個硫酸銅質(zhì)量濃度梯度，每個質(zhì)量濃度梯度設(shè)置3個平行，另設(shè)空白對照組(表1)；試驗(yàn)過程采用半靜水法，每間隔24 h全部換水更新藥液，試驗(yàn)期間不投餌。試驗(yàn)容器為15 L的聚乙烯塑料桶，試驗(yàn)水體為10 L，每桶試驗(yàn)魚10尾。在試驗(yàn)的過程中仔細(xì)觀察并記錄試驗(yàn)魚的活動情況和中毒癥狀，及時撈出死魚，并記錄24、48、72、96 h雙斑東方鲀幼魚的死亡和存活情況。試驗(yàn)用水為砂濾海水，水溫(27±1) ℃、鹽度23～25，pH 7.90～8.10，溶解氧>6.00 mg/L。

表1 硫酸銅急性毒性試驗(yàn)的質(zhì)量濃度

1.2.2 患病病魚檢查及病原形態(tài)學(xué)觀察

首先病魚(帶水)外觀觀察，然后病魚(出水后)體表、鰓和臟器解剖檢查，分析體表、鰓絲及臟器典型性表觀病理特征。取鰭條、體表黏液、鰓片以及各內(nèi)臟組織器官制成水浸片，置于Lw200-20T光學(xué)顯微鏡下觀察，進(jìn)行可疑病原確定及觀察其形態(tài)特征。

1.2.3 病魚治療試驗(yàn)

依據(jù)毒性試驗(yàn)結(jié)果并按其安全質(zhì)量濃度以下設(shè)置3組硫酸銅用藥質(zhì)量濃度，另設(shè)空白對照組(表2)；每組質(zhì)量濃度梯度設(shè)3個平行藥浴病魚，其中2個平行統(tǒng)計(jì)病魚存活情況，另一平行用于病魚每日取樣檢查。試驗(yàn)容器為500 L的玻璃鋼桶，試驗(yàn)水體為400 L，各桶放養(yǎng)病魚30 尾，微充氣增氧，每日按質(zhì)量濃度施藥，施藥前100%換水，用藥期間正常投喂適量的餌料。每日施藥前，觀察和記錄各試驗(yàn)組病魚活動及存活情況，然后自檢查的平行組中隨機(jī)選取2尾病魚，進(jìn)行體表外觀觀察、鰓絲鏡檢及臟器檢查，記錄刺激隱核蟲蟲體特征和數(shù)量情況。每日鏡檢各試驗(yàn)組病魚，如發(fā)現(xiàn)雙斑東方鲀魚體有刺激隱核蟲的繼續(xù)按試驗(yàn)質(zhì)量濃度藥浴治療；未發(fā)現(xiàn)有刺激隱核蟲的停止施藥，換至自然海水養(yǎng)殖觀察至第14 d。試驗(yàn)用水為砂濾海水，水溫22～24 ℃、鹽度23～25，pH 7.90～8.10，溶解氧>6.50 mg/L。

表2 硫酸銅對雙斑東方鲀刺激隱核蟲病的治療質(zhì)量濃度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.3.1 急性毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)硫酸銅各質(zhì)量濃度組的雙斑東方鲀幼魚死亡情況，計(jì)算出24、48、72、96 h幼魚的死亡率，然后根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用SPSS 18.0軟件和概率單位回歸法[22]計(jì)算出24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度(LC50)；安全質(zhì)量濃度(SC)按下式計(jì)算[23]：

SC=0.3×48 h LC50/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.3.2 治療試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每日施藥前，統(tǒng)計(jì)硫酸銅各質(zhì)量濃度組病魚存活情況，計(jì)算出各組雙斑東方鲀存活率；鏡檢各組病魚的體表和鰓，在顯微鏡(4×10)下觀察4個視野以上，以各視野中蟲體數(shù)量的平均值為蟲體數(shù)，記錄體表和鰓的刺激隱核蟲活體數(shù)量，并確認(rèn)蟲體感染程度。

2 結(jié) 果

2.1 硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚的毒性效應(yīng)

雙斑東方鲀幼魚暴露在最低質(zhì)量濃度的硫酸銅試驗(yàn)組中，體色及游動情況正常，與對照組無差別；暴露在高質(zhì)量濃度的硫酸銅試驗(yàn)組中，幼魚中毒癥狀表現(xiàn)：魚體在水面亂竄，鰓蓋張合頻率快、呼吸急促，體表體色變淺。當(dāng)硫酸銅質(zhì)量濃度為8.00 mg/L時，4 h后出現(xiàn)個體死亡，死亡時鰓張開，軀體變形、翻肚，體色白化，體表黏液多，24 h死亡率為53.3%，48 h死亡率為63.3%，96 h全部死亡；當(dāng)硫酸銅質(zhì)量濃度為5.23 mg/L時，48 h死亡率為23.3%，96 h死亡率為50%；當(dāng)硫酸銅質(zhì)量濃度為1.50 mg/L時，96 h未發(fā)現(xiàn)死亡。隨著硫酸銅脅迫質(zhì)量濃度的升高和脅迫時間的延長，硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚毒性明顯增強(qiáng)，暴露于各質(zhì)量濃度組的雙斑東方鲀幼魚死亡率也明顯升高(表3)。硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為7.94、7.12、5.32、4.44 mg/L，安全質(zhì)量濃度為1.72 mg/L(表3)。

2.2 病魚檢查及病原形態(tài)學(xué)觀察

外觀觀察雙斑東方鲀病魚，體表、鰭條和鰓絲有肉眼可見“小白點(diǎn)”(圖1a～c)；取體表黏液、鰭條、鰓絲鏡檢，可觀察到卵圓形或橢圓形的蟲體，直徑為200～400 μm，內(nèi)部有一個“U”型的大核，顯微鏡下蟲體透明度低且呈黑乳白色，多數(shù)難見其大核(圖1d～g)；卵圓形或橢圓形蟲體前端有胞口結(jié)構(gòu)，蟲體體表有均勻一致的纖毛，蟲體不透明，能緩慢且不停地旋轉(zhuǎn)(圖1h)。病情嚴(yán)重時，病魚對外界刺激反應(yīng)遲鈍，呼吸困難，離群，游動遲緩，偶爾在水里亂竄，無食欲，體型消瘦，部分病魚鰭條缺損；鏡檢鰓絲發(fā)現(xiàn)有大量蟲體，黏液多(圖1i)；肝臟充血嚴(yán)重，腹腔內(nèi)有大量白色黏液(圖1j)；體表形成一層白色混濁狀黏膜(圖1k)。結(jié)合蟲體及病魚特征[24-25]，確定該寄生蟲為刺激隱核蟲。

表3 硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 刺激隱核蟲及患刺激隱核蟲病的雙斑東方鲀幼魚a.雙斑東方鲀體表“小白點(diǎn)”(箭頭所示)； b.鰭條“小白點(diǎn)”(箭頭所示)； c.鰓絲“小白點(diǎn)”(箭頭所示)； d.體表黏液的刺激隱核蟲(箭頭所示,×40)； e.鰭上的刺激隱核蟲(箭頭所示,×60)； f.鰓上的刺激隱核蟲(箭頭所示,×40)； g.鰓上刺激隱核蟲蟲體外包一層薄膜(箭頭所示,×40)； h.刺激隱核蟲蟲體(箭頭示胞口，×100)； i.感染嚴(yán)重時，鰓絲上有大量蟲體，黏液多(箭頭所示)； j.肝臟充血嚴(yán)重(箭頭Ⅰ所示)，腹腔有黏液(箭頭Ⅱ所示)； k.感染嚴(yán)重的幼魚體表出現(xiàn)一層白色黏膜(箭頭所示).

2.3 硫酸銅對雙斑東方鲀刺激隱核蟲病的治療效果

治療試驗(yàn)結(jié)果表明(表4、圖2)，1.0 mg/L和1.5 mg/L的硫酸銅質(zhì)量濃度組對刺激隱核蟲病的治療效果良好，第3 d就出現(xiàn)部分蟲體解體(圖3a～c)或脫落，刺激隱核蟲蟲體逐漸減少，至第5 d蟲體密度大量降低，第6 d鏡檢，鰭條、鰓絲和體表未發(fā)現(xiàn)有蟲體(圖3d～f)，至第14 d鏡檢仍未發(fā)現(xiàn)有蟲體，魚游動活潑、活力良好，成活率達(dá)100%；0.5 mg/L硫酸銅質(zhì)量濃度組治療效果不佳，第3 d開始，雙斑東方鲀體表黏液增多，第5 d，蟲體增多，雙斑東方鲀體表白膜嚴(yán)重，第7 d，雙斑東方鲀鰓出現(xiàn)大量黏液團(tuán)、上皮組織增生，肝臟嚴(yán)重充血(圖4)，雙斑東方鲀出現(xiàn)大量死亡，第8 d，雙斑東方鲀?nèi)克劳?，死亡時體表背部覆蓋一層黏泥；對照組(0 mg/L)雙斑東方鲀病情發(fā)展迅速，第3 d，雙斑東方鲀體表形成一層白色混濁狀黏膜，第5 d，雙斑東方鲀?nèi)克劳?，死亡時體表背部覆蓋一層黏泥。

表4 硫酸銅對患刺激隱核蟲病的雙斑東方鲀幼魚治療效果

注：①體表蟲體數(shù)量感染程度確定方法[26]：平均蟲體數(shù)量大于10個時，用“+++”表示；平均數(shù)量為5～10個，用“++”表示；平均數(shù)量5個以下，用“+”表示；沒有蟲體的用“-”表示。②鰓蟲體數(shù)量感染程度確定方法[27]：平均蟲體數(shù)量為2.0個以上時，用“+++”表示；平均數(shù)量為1.0～2.0個，用“++”表示；平均數(shù)量在1.0個以下時，用“+”表示；沒有蟲體的用“-”表示.

圖2 硫酸銅治療過程中雙斑東方鲀病魚存活情況

圖3 1.0、1.5 mg/L硫酸銅對雙斑東方鲀刺激隱核蟲病的治療情況a.用藥前，正常的刺激隱核蟲蟲體(箭頭所示，×40)； b.用藥第3 d，刺激隱核蟲蟲體開始解體(箭頭所示，×40)； c.刺激隱核蟲蟲體解體(箭頭所示，×40)； d.用藥5 d后，鰭條干凈無蟲體； e.用藥5 d后，鰓鏡檢無蟲體； f.用藥5 d后，魚體表干凈無蟲體.

圖4 0.5 mg/L硫酸銅對雙斑東方鲀刺激隱核蟲病的治療情況a.用藥后第7 d，鰓出現(xiàn)大量黏液團(tuán)(箭頭所示，×40)； b.用藥后第7 d，鰓上皮組織增生(箭頭所示，×40)； c.用藥后第7 d，肝臟嚴(yán)重充血(箭頭所示).

3 討 論

3.1 硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚的毒性評價

硫酸銅屬重金屬鹽類，其銅離子易使病原體體內(nèi)的酶失去活性，從而阻礙病原體的繁殖、生長，常作為水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物用于殺滅寄生的原生動物病原[28]。有關(guān)硫酸銅對海水魚類急性毒性研究比較多，不同海水魚類對硫酸銅耐受能力不一樣，如對雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)[29]的安全質(zhì)量濃度為0.96 mg/L、對眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)[30]的安全質(zhì)量濃度為1.65 mg/L、對大菱鲆(Scophtbalmusmaximus)[31]的安全質(zhì)量濃度為0.46 mg/L、對菊黃東方鲀(T.flavidus)仔魚[32]的安全質(zhì)量濃度為0.76 mg/L、對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)稚魚[33]的安全質(zhì)量濃度為0.21 mg/L、對漠斑牙鲆(P.lethostigma)幼魚[34]的安全質(zhì)量濃度為0.667 mg/L、對點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚的[35]安全質(zhì)量濃度為1.485 mg/L、對斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)幼魚[36]的安全質(zhì)量濃度為1.42 mg/L。由于硫酸銅對不同魚類的安全質(zhì)量濃度差異大，需要通過毒性試驗(yàn)來確定各種魚類的安全質(zhì)量濃度，然后結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確認(rèn)硫酸銅是否適合治療該魚類。本研究結(jié)果表明，硫酸銅對雙斑東方鲀幼魚的安全質(zhì)量濃度為1.72 mg/L，高于生產(chǎn)建議使用的質(zhì)量濃度0.70～1.0 mg/L，在此安全質(zhì)量濃度下可放心使用硫酸銅。但使用時需注意，銅離子易在生物體累積，會引起機(jī)體生理、生化及組織病理等變化[37]，故生產(chǎn)上忌長期使用；商品魚上市前應(yīng)留有足夠休藥時間，以保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

3.2 硫酸銅對刺激隱核蟲病的治療效果

硫酸銅對寄生于海水魚類的刺激隱核蟲、淀粉渦鞭蟲(Amyloodiniumocellatum)、車輪蟲(Trichodina)、斜管蟲(Chilodonella)、瓣體蟲(Petalosoma)等纖毛蟲類有一定的殺滅效果[18-20,36,38-39]，生產(chǎn)上常用于防治纖毛蟲類病害。硫酸銅對海水魚類刺激隱核蟲病臨床治療報道較多，如陸建學(xué)等[18]報道，2.0 mg/L硫酸銅治療黃鯛(Taiustumifrons)刺激隱核蟲病經(jīng)濟(jì)有效；王印庚等[19]報道，2.0 mg/L的硫酸銅雖能殺死大菱鲆體表刺激隱核蟲，但可導(dǎo)致部分病魚死亡；王忠華等[20]報道，2.0 mg/L硫酸銅可使大黃魚(Pseudosciaenacrocea)體表刺激隱核蟲活力下降，解體死亡，但因大黃魚耐受安全質(zhì)量濃度較低，治療時易造成大黃魚死亡；竇海鴿等[40]報道，小劑量硫酸銅會促使刺激隱核蟲蟲體胞囊形成，加快病情惡化，治療無效。硫酸銅還可殺滅體外發(fā)育各期的刺激隱核蟲[41]。本研究結(jié)果表明，1.0 mg/L和1.5 mg/L的硫酸銅對雙斑東方鲀刺激隱核蟲病治療有效，可以使體表刺激隱核蟲活力和數(shù)量下降，蟲體解體或脫落，用藥5 d后治愈；生產(chǎn)上考慮用藥經(jīng)濟(jì)性，建議使用1.0 mg/L硫酸銅質(zhì)量濃度治療。不同魚類對硫酸銅質(zhì)量濃度耐受程度不同，如大黃魚、大菱鲆耐受程度低，雙斑東方鲀耐受程度高，治療時需嚴(yán)格按硫酸銅對各魚類安全質(zhì)量濃度來控制使用，同時結(jié)合考慮溶解氧、水溫、有機(jī)質(zhì)等環(huán)境因子和魚類活動情況，做到科學(xué)合理用藥，確保治療安全、有效。

3.3 臨床有效防治雙斑東方鲀刺激隱核蟲病

自日本學(xué)者Sikama[42]首次發(fā)現(xiàn)刺激隱核蟲，至今刺激隱核蟲病仍是危害嚴(yán)重的致死性纖毛蟲病之一，幾乎侵害所有海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，包括大黃魚、大菱鲆、真鯛(Pagrosomusmajor)、石斑魚、東方鲀、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)等[19-20,43-44]，嚴(yán)重威脅魚類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。所以臨床上有效防治養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類刺激隱核蟲病意義重大。

治療刺激隱核蟲病關(guān)鍵因素是治療時間節(jié)點(diǎn)的選擇，發(fā)病初、中期防治治療有效，發(fā)病后期病情發(fā)展快，藥物基本上無療效。雙斑東方鲀刺激隱核蟲病發(fā)生進(jìn)程為：發(fā)病初期(圖5a)，病魚體表、各鰭條出現(xiàn)少量白色小點(diǎn)，帶水目測觀察，肉眼可見，鰓鏡檢有少量刺激隱核蟲蟲體；發(fā)病中期(圖5b)，病魚體表、鰭條、鰓等部位出現(xiàn)許多肉眼可見的小白點(diǎn)，體表和鰓黏液多，少數(shù)病魚出現(xiàn)游動異常，在水面游動、摩擦池壁；發(fā)病后期(圖5c)，病魚體表形成一層渾濁狀白色黏膜，病魚離群，魚體消瘦，游動遲緩，反應(yīng)遲鈍，偶爾間歇亂竄，呼吸困難，無食欲，鏡檢鰓絲發(fā)現(xiàn)有大量蟲體，黏液多且覆蓋鰓絲，鰓上皮細(xì)胞增生，肝臟充血嚴(yán)重，腹腔內(nèi)有大量黏液；死亡期(圖5d)，病魚死亡且體表背部覆蓋一層黏泥。本研究治療試驗(yàn)是在雙斑東方鲀發(fā)生刺激隱核蟲病中期期間進(jìn)行的。生產(chǎn)實(shí)踐中，在刺激隱核蟲病發(fā)病初期用1.0 mg/L硫酸銅藥浴治療雙斑東方鲀病魚，持續(xù)藥浴3 d，即可治愈；而發(fā)病中期需用1.0 mg/L硫酸銅持續(xù)藥浴治療5 d以上方可治愈，這應(yīng)該與發(fā)病中期期間部分刺激隱核蟲蟲體被魚體表層細(xì)胞分泌的增生物包圍，形成一層薄膜有關(guān)[14](圖1h),導(dǎo)致藥物消殺蟲體時間延長。刺激隱核蟲病防治難點(diǎn)在于該病易突然暴發(fā)、早期不易察覺，但雙斑東方鲀屬無鱗魚，相對其他有鱗的海水魚類發(fā)病早期體表更易觀察到“白點(diǎn)”，所以在刺激隱核蟲病流行期間養(yǎng)殖生產(chǎn)者要經(jīng)常目測(帶水)觀察雙斑東方鲀魚體體表情況，查看是否有肉眼可見的“白點(diǎn)”。通過勤觀察，做到對刺激隱核蟲早發(fā)現(xiàn)、早用藥，確保藥物治療及時有效。

圖5 雙斑東方鲀刺激隱核蟲病發(fā)生進(jìn)程(右下角為放大圖)a.發(fā)病初期，體表有少量肉眼可見“小白點(diǎn)”(箭頭所示)； b.發(fā)病中期，體表出現(xiàn)許多“小白點(diǎn)”，黏液多(箭頭所示)； c.發(fā)病后期，魚體消瘦，體表形成一層渾濁狀的白色黏膜(箭頭所示)； d.死亡期，死亡病魚體表背部覆蓋一層黏泥(箭頭所示).

總之，硫酸銅是治療刺激隱核蟲病有效藥物之一，但如果不當(dāng)使用，不僅造成防治效果不佳或損傷魚體，甚至還會破壞水生態(tài)環(huán)境。本研究確定了硫酸銅對雙斑東方鲀的安全質(zhì)量濃度和對刺激隱核蟲病的有效治療質(zhì)量濃度，為雙斑東方鲀養(yǎng)殖過程中臨床治療刺激隱核蟲病提供技術(shù)支撐，對治療其他魚類刺激隱核蟲病及其纖毛蟲病具有一定指導(dǎo)意義。