蔡瑩瑩 陳星星 谷風(fēng)林 徐 飛

(1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北武漢 430070；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬(wàn)寧 571533；3國(guó)家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心 海南萬(wàn)寧 571533；4海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心 海南萬(wàn)寧 571533)

香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)又名香莢蘭，原產(chǎn)于墨西哥，典型的熱帶蘭科作物，被譽(yù)為“食品香料之王”[1]。它是食品、飲料和化妝品中最重要和最受歡迎的芳香植物之一[2-3]。香草蘭的鮮豆莢沒(méi)有特別的香味，但在經(jīng)過(guò)殺青、發(fā)汗、干燥、陳化4個(gè)階段的發(fā)酵，在陳化豆莢中會(huì)產(chǎn)生特有的香氣。目前關(guān)于香草蘭的發(fā)酵生香機(jī)理還不是很清楚，一般認(rèn)為香草蘭中的風(fēng)味物質(zhì)是在葡萄糖苷酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶等酶的作用下由風(fēng)味前體物水解而形成[4]。此外，由于豆莢在發(fā)酵過(guò)程中一直與外界環(huán)境相接觸，這就不可避免豆莢上有微生物的生長(zhǎng)，而微生物的生長(zhǎng)必然會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，這些都影響到了風(fēng)味物質(zhì)的形成[5-6]。關(guān)于微生物可能參與發(fā)酵生香有大量報(bào)道，比如General等研究表明，從香草蘭豆莢上分離到的由酵母分泌的糖苷酶能夠?qū)⑽核徂D(zhuǎn)化為香草酸等其他多種化合物[7]。因此內(nèi)源酶和微生物對(duì)香草蘭的發(fā)酵生香都起著很重要的作用。對(duì)于不同產(chǎn)地和品種的香草蘭豆莢目前已經(jīng)鑒定出460種以上的揮發(fā)性成分，主要包括芳香酯、醛類、酚類、酮類、脂肪酸等[8-10]，其中香蘭素、香草酸、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸等物質(zhì)含量較高，對(duì)香味的貢獻(xiàn)也較大[11]。在課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)這些風(fēng)味成分的前體物主要是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、對(duì)香豆酸、松柏醇等[12]。此外鮮豆莢經(jīng)過(guò)殺青之后其生命活力已經(jīng)停止，細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)受到破壞，蛋白在這個(gè)過(guò)程中可能發(fā)生了變化，并且蛋白也可能參與了酶促氧化和非酶氧化。

香草蘭豆莢中的風(fēng)味成分及其前體物在發(fā)酵過(guò)程中不斷消耗和生成，但是對(duì)于主要風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中哪個(gè)階段形成，以及在發(fā)酵過(guò)程中是如何進(jìn)行累積的，還不是很清楚。因此，本文采用LC-MS/MS方法探究香草蘭發(fā)酵過(guò)程中主要物質(zhì)及其糖苷前體物的消長(zhǎng)規(guī)律，并且采用電泳方法探究蛋白的變化，為完善生香加工技術(shù)，提高豆莢質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

不同發(fā)酵階段的香草蘭豆莢(鮮豆莢(FVB)，殺青豆莢(BVB)，發(fā)汗豆莢(SVB)，干燥豆莢(DVB)，陳化豆莢(CVB))由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、乙醇購(gòu)自Merck公司，均為色譜純。尿素、碘乙酰胺、硫脲、維生素C、十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙硫酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨購(gòu)自Sigma(St．Louis， MO， USA)。 DNA提取酚試劑購(gòu)自Solarbio，瓊脂糖、24 cm IPG膠條(pH3-10)購(gòu)自GE Healthcare(Uppsala，Sweden)。丙烯酰胺、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自Bio-Rad Labs(Richmond，CA，USA)。其余藥品試劑：丙酮、硫酸銨、乙酸、蔗糖、硼砂、甘油、甲醇、磷酸、乙醇等購(gòu)自北京化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

研磨儀(MM 400，Retsch)， 超高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)，串聯(lián)質(zhì)譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5810R，德國(guó))， 島津紫外分光光度計(jì)(UV-2450，日本)， 恒溫?fù)u床(C25kc，美國(guó))， 等電聚焦儀Ettan IPGphor 3(GE Healthcare)，垂直電泳儀Ettan DALTtwelve(GE Healthcare)，Image ScannerⅢ投射掃描儀(GE Healthcare)等。

1.2 方法

1.2.1 代謝物樣品的提取和定量

(1)樣品提取

不同發(fā)酵階段的香草蘭豆莢經(jīng)真空冷凍干燥后利用研磨儀研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀；然后分別稱取100 mg的粉末，加入1.0 mL 70%的甲醇水溶液，4℃冰箱過(guò)夜，期間渦旋3次，提高提取率；最后將樣品在4℃以10 000 g的轉(zhuǎn)速，離心10 min分鐘，吸取上清液，并用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，用于LC-MS/MS分析。

(2)色譜質(zhì)譜采集條件

a.液相條件主要包括：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm， 2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min水/乙腈(95∶5 V/V)， 11.0 min為 5∶95 V/V， 12.0 min為 5∶95 V/V， 12.1 min為 95∶5 V/V， 15.0 min為95∶5 V/V；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量 2 μL。

b.質(zhì)譜條件主要包括：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度500℃，質(zhì)譜電壓5 500 V， 簾氣(curtain gas，CUR)25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(collision-activated dissociation，CAD)參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級(jí)桿中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)，具體參數(shù)如表1。

表1 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)[13]

(3)代謝物定性與定量

基于 MassBank， KNAPSAcK， HMDB， MoTo DB，METLIN和別的已經(jīng)存在的代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對(duì)所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分，并對(duì)其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正[14]。

1.2.2 蛋白的提取和定量

參考Saravanan等[15]的方法進(jìn)行蛋白的提取，并加以調(diào)整。稱量2 g的香草蘭豆莢粉末加入10 mL BPP蛋白提取液[2%2-巰基乙醇(V/V)、EDTA100 mmol/L， 30%蔗糖(m/V)、 Tris 10 mmol/L， 維生素 C 50 mmol/L、 硼砂 50 mmol/L、 1%Triton-100(V/V)、 1%PVPP(m/V)，pH 8.0]，在室溫下渦旋混勻10 min后加入7 mL的DNA提取酚試劑，室溫渦旋10 min，離心(4℃，15 000×g)15 min。將上層酚相轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，加入等體積BPP蛋白提取液，室溫渦旋5 min，離心(4℃，15 000×g)15 min。小心吸取上層清液與5倍體積預(yù)冷的過(guò)飽和硫酸銨甲醇溶液混勻后，-20℃沉淀6 h以上。懸浮液離心(4℃，15 000×g)15 min后，收集沉淀。沉淀用預(yù)冷的甲醇洗滌2次，隨后用預(yù)冷的丙酮洗滌2次，室溫干燥后溶解于蛋白裂解液(2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT，2%CHAPS)中，-20℃保存?zhèn)溆?。蛋白質(zhì)定量參考Bradford法[16]，用牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

1.2.3 電泳

(1)SDS-PAGE電泳

二維凝膠電泳(1-DE)：主要采用不連續(xù)膠SDS-PAGE法[17]，用4%濃縮膠和12.5%分離膠進(jìn)行電泳分離，蛋白上樣量為30 μg，電泳參數(shù)設(shè)置為7 W/gel 2 h。

(2)雙向電泳

二維凝膠電泳(2-DE)：第一向等電點(diǎn)聚焦在Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀上完成。使用24 cm的pH 3-10線性IPG干膠條，每根膠條上樣量為1 500 mg蛋白，上樣體積455 uL，常溫水化18 h，每根膠條上覆蓋5 mL礦物油防止樣品揮發(fā)。聚焦程序設(shè)定為： 250 V， 3 h； 500 V， 2 h； 1 000 V， 1 h；8 000 V，3 h；8 000 V下進(jìn)行110 000 Vhrs聚焦，每根膠條限流50 μA。第二向電泳前進(jìn)行膠條平衡，將聚焦好的膠條放入平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.8， 2%SDS， 30%甘油， 6 mol/L 尿素，0.02%溴酚藍(lán))中平衡，先后浸泡在1%DTT的膠條平衡液和含4%碘乙酰胺的膠條平衡液中，各15 min。平衡結(jié)束后，轉(zhuǎn)移膠條垂直放于12.5%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)的上端，用含有適量溴酚藍(lán)的1%瓊脂糖封住膠條，保證膠條與凝膠充分接觸，在Ettan Daltsix電泳儀中進(jìn)行電泳，電泳參數(shù)設(shè)置為5 W/gel 1 h， 7 W/gel 3.5 h。

(3)凝膠染色及圖像采集分析

凝膠染色主要采用考馬斯亮藍(lán)(G-250)染色液進(jìn)行染色[18]。脫色干凈的凝膠采用Image ScannerⅢ掃描儀進(jìn)行掃描。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行均值計(jì)算及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵階段的香草蘭豆莢主要前體物與風(fēng)味成分的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 主要風(fēng)味前體物的動(dòng)態(tài)變化

(1)L-苯丙氨酸

如圖1-A1所示，L-苯丙氨酸隨著發(fā)酵的進(jìn)行含量逐漸增加，發(fā)汗階段達(dá)到頂峰，進(jìn)一步發(fā)酵時(shí)含量降低，說(shuō)明L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為風(fēng)味成分可能主要在干燥和陳化階段。酶對(duì)L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化為香蘭素起著重要的作用。人們普遍認(rèn)為香蘭素是L-苯丙氨酸經(jīng)過(guò)苯丙烷途徑的產(chǎn)物，并且芳香環(huán)的4位羥基是通過(guò)細(xì)胞色素P450酶和肉桂酸羥化酶的作用而產(chǎn)生[19]。并且由于豆莢在發(fā)酵過(guò)程中一直與外界環(huán)境相接觸，因此微生物可能參與了L-苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化，有研究表明幾種白腐真菌和變形桿菌具有苯丙氨酸氨裂解酶活性，苯丙氨酸在苯丙氨酸氨裂解酶的作用下脫氨基成反式肉桂酸，進(jìn)一步形成香蘭素的前體如松柏醇，阿魏酸和松柏醛，最終形成香蘭素[2]。

(2)L-酪氨酸

如圖1-A2所示，L-酪氨酸在殺青階段含量最高，可能是由于殺青時(shí)豆莢的細(xì)胞組織受到破壞，使得其他與酪氨酸以結(jié)合形式存在的物質(zhì)發(fā)生了水解或轉(zhuǎn)化，釋放了酪氨酸，也可能來(lái)源于蛋白的降解。在發(fā)汗、干燥、陳化階段含量逐漸降低，說(shuō)明L-酪氨酸可能主要在發(fā)汗、干燥、陳化階段參與風(fēng)味成分的轉(zhuǎn)化。由于豆莢在發(fā)酵過(guò)程中一直與外界環(huán)境相接觸，也可能有多種微生物參與了L-酪氨酸的轉(zhuǎn)化。

(3)阿魏酸

如圖1-A3所示，阿魏酸在殺青階段含量有所增加，可能是由于殺青時(shí)豆莢的組織結(jié)構(gòu)被破壞，使得以結(jié)合形式存在于細(xì)胞壁的阿魏酸糖苷與酶接觸，通過(guò)酶解作用釋放游離的阿魏酸，使得阿魏酸的含量有所增加[20]。然而在發(fā)汗階段阿魏酸的含量有所下降，說(shuō)明阿魏酸轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)可能主要發(fā)生在發(fā)汗階段。發(fā)汗使得殺青后的豆莢快速脫水干燥，避免后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中霉菌的生長(zhǎng)。此外，這個(gè)階段提高處理溫度，酶活性被激發(fā)，促進(jìn)了風(fēng)味前體物的水解[21]。Gallage等[22]研究表明，阿魏酸及其葡糖苷在香草醛合成酶(VpVAN)的作用下可以直接轉(zhuǎn)化為香蘭素及其葡糖苷。而在干燥和陳化階段阿魏酸的的含量又逐漸升高，可能來(lái)自于別的物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

(4)葡萄糖

如圖1-A4所示，從鮮豆莢到殺青豆莢葡萄糖的含量逐漸升高，在發(fā)汗階段下降，可能是葡糖苷的水解未達(dá)到高峰期，并且已經(jīng)水解的一部分葡萄糖作為底物被反應(yīng)掉。而在干燥和陳化階段葡萄糖的的含量又逐漸升高，可能是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，葡糖苷的不斷水解，風(fēng)味成分和葡萄糖逐漸被釋放出來(lái)[19]，葡萄糖的含量逐漸回升，陳化階段達(dá)到最高。

(5)咖啡酸和肉桂酸

如圖1-A5和1-A6所示，咖啡酸和肉桂酸在鮮豆莢到發(fā)汗豆莢中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，含量逐漸升高，在干燥階段開(kāi)始下降，陳化階段進(jìn)一步升高，說(shuō)明咖啡酸和肉桂酸轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)可能主要在干燥階段進(jìn)行，并且二者之間的含量變化是相關(guān)的。Funk和Brodelius研究表明咖啡酸可以通過(guò)甲基化生成異-阿魏酸，隨后生成3，4二甲基肉桂酸，該化合物進(jìn)一步形成香蘭酸，香蘭素[23-25]。

圖1 不同發(fā)酵階段香草蘭豆莢風(fēng)味前體物的動(dòng)態(tài)變化

(6)對(duì)香豆酸和松柏醇

如圖1-A7和1-A8所示，從鮮豆莢到干燥階段，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)香豆酸和松柏醇的含量逐漸降低，說(shuō)明對(duì)香豆酸和松柏醇可能主要在前4個(gè)階段參與反應(yīng)。Podstolski研究表明，對(duì)香豆酸在非氧化性鏈縮短酶4HBS的作用下可以轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲醛[5]。 陳化階段有所回升，可能來(lái)源于別的物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，如酪氨酸在苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸氨裂解酶共同作用下可以形成對(duì)香豆酸[26]。阿魏酸也可以直接還原成松柏醇或去甲基化成咖啡酸[16]。木質(zhì)素在木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和漆酶的作用下解聚為愈創(chuàng)木酚中間體，再進(jìn)一步也轉(zhuǎn)化為許多酚類化合物，如松柏醇、松柏醛、阿魏酸、香蘭素、香草酸和對(duì)羥基肉桂醛等[19]。

2.1.2 主要風(fēng)味成分的動(dòng)態(tài)變化

(1)香草酸和香蘭素

發(fā)酵過(guò)程中香草酸和香蘭素的含量的變化如圖2-B1和2-B2所示。由圖可知隨著發(fā)酵的進(jìn)行，香草酸和香蘭素的含量逐漸增加，在陳化豆莢中含量最高。這一點(diǎn)也和實(shí)際情況具有一致性，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，香氣逐漸變得濃郁，說(shuō)明主要的風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量都得到進(jìn)一步的增強(qiáng)，并且和其他階段相比，陳化為發(fā)酵的最后一步，歷時(shí)半年以上，這期間豆莢會(huì)發(fā)生多種化學(xué)反應(yīng)和生化反應(yīng)，如酯化、醚化、氧化等反應(yīng)，形成香草蘭特有香氣[27]。從圖中也可以看出，香草酸主要在陳化階段產(chǎn)生，然而香蘭素主要產(chǎn)生于發(fā)汗階段。香蘭素在發(fā)汗之后增加緩慢，可能是因?yàn)橐徊糠窒闾m素參與了不同的化學(xué)或酶促反應(yīng)，而這些反應(yīng)也可能會(huì)形成香氣化合物，這對(duì)于確定香草蘭的最終質(zhì)量至關(guān)重要[28-30]，而且Havkin-Frenkel等研究也表明，干燥和陳化會(huì)導(dǎo)致香蘭素和其他風(fēng)味物質(zhì)的損失[31]。另外與香氣形成沒(méi)有直接關(guān)系的其他反應(yīng)也可以解釋香蘭素的這些損失，例如升華，與水共蒸發(fā)[30]，或與豆莢中的木質(zhì)素形成共價(jià)鍵[29]。因此，香蘭素的實(shí)際產(chǎn)量高于我們所檢測(cè)到的含量。

(2)對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛

發(fā)酵過(guò)程中對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛的含量的變化如圖2B3和B4所示，由圖可知隨著發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛都是在發(fā)汗階段含量最低，在干燥和陳化階段逐漸升高。這一點(diǎn)和浦帆等的研究結(jié)果具有一致性[32]。研究表明陳化豆莢中對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛濃度分別為100 mg/kg干重和1 g/kg干重[11]。在現(xiàn)代分析技術(shù)的支持下，在鮮豆莢中發(fā)現(xiàn)了對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛的糖苷[22，33]。因此，對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛可能來(lái)自于其葡萄糖苷的水解，并且這種水解反應(yīng)可能主要在干燥階段和陳化階段發(fā)生。

圖2 不同發(fā)酵階段香草蘭豆莢主要風(fēng)味成分的動(dòng)態(tài)變化

2.2 蛋白的動(dòng)態(tài)變化

如圖3所示，SDS-PAGE分析結(jié)果表明：不同發(fā)酵階段的香草蘭蛋白有很大的差異，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行蛋白逐漸減少。其中鮮豆莢的蛋白分布范圍比較寬，蛋白主要集中在26～90 kD。和鮮豆莢相比，殺青豆莢的蛋白有所減少，其中小于19 kD的蛋白消失。和鮮豆莢相比，發(fā)汗豆莢，干燥豆莢，陳化豆莢的蛋白變化非常明顯，蛋白數(shù)量明顯減少，分子量集中表現(xiàn)在19～35 kD和蛋白條帶上部，說(shuō)明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蛋白可能發(fā)生了部分降解和一些交聯(lián)。Hansen等[34]研究表明，在酪蛋白酸鈉或乳清蛋白濃縮物存在下香蘭素的風(fēng)味強(qiáng)度會(huì)降低，作者猜測(cè)這種降低可能是由于半胱氨酸-醛縮合或希夫堿形成。Pkw等[35]研究表明增加香蘭素和蠶豆蛋白質(zhì)膠束(PMM)的濃度可以增加蛋白質(zhì)與香蘭素結(jié)合的百分比，熱處理(變性)PMM的結(jié)合能力高于未處理(天然)PMM的結(jié)合能力。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行香蘭素的含量是逐漸升高的，因此蛋白可能發(fā)生了降解或則交聯(lián)。在發(fā)汗和干燥階段在35 kD左右和19 kD左右的蛋白條帶顏色逐漸加深，說(shuō)明此區(qū)間內(nèi)亞基種類增多，所占比例增大。但是在陳化階段，和發(fā)汗和干燥階段相比，35 KD左右和19 KD左右的蛋白條帶顏色變淺，可能是由于陳化生香期間蛋白發(fā)生了降解。從3-DE圖譜中可以看出隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蛋白的數(shù)量變少了，這和SDS-PAGE電泳圖的結(jié)果具有一致性。

3 討論與結(jié)論

圖3 不同發(fā)酵階段香草蘭豆莢蛋白的SDS-PAGE電泳圖和雙向電泳圖

通過(guò)LC-MS/MS方法探究了不同發(fā)酵階段的香草蘭豆莢主要風(fēng)味前體物L(fēng)-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、對(duì)香豆酸、松柏醇的消長(zhǎng)規(guī)律和主要風(fēng)味物質(zhì)香草酸、香蘭素、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛的消長(zhǎng)規(guī)律。對(duì)于主要風(fēng)味前體物而言，L-苯丙氨酸的含量在發(fā)汗階段最高。而L-酪氨酸的含量在發(fā)汗、干燥、陳化階段逐漸降低。阿魏酸和葡萄糖的含量從鮮豆莢到殺青豆莢呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，發(fā)汗階段下降，干燥和陳化階段又逐漸升高?？Х人岷腿夤鹚岬暮吭邗r豆莢到發(fā)汗階段呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在干燥階段開(kāi)始下降，陳化階段開(kāi)始回升。對(duì)香豆酸和松柏醇從鮮豆莢到干燥階段的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，陳化階段開(kāi)始回升；對(duì)于主要風(fēng)味物質(zhì)而言，香草酸和香蘭素的含量從殺青階段到陳化階段逐漸增加。在發(fā)汗階段對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯甲醛的含量最低，在干燥和陳化階段逐漸升高。此外還探究了不同發(fā)酵階段的香草蘭豆莢蛋白的動(dòng)態(tài)變化，電泳圖表明隨著發(fā)酵的進(jìn)行蛋白條帶逐漸減少，并且鮮豆莢和殺青豆莢的蛋白分布范圍比較寬，陳化豆莢的蛋白分布范圍比較集中。本文主要探究了主要風(fēng)味成分及其前體物的消長(zhǎng)規(guī)律，而對(duì)于在發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味前體物與風(fēng)味前體物之間，風(fēng)味成分與風(fēng)味成分之間，前體物與風(fēng)味成分之間的相互轉(zhuǎn)化，可能是通過(guò)內(nèi)源酶或與豆莢互作的微生物進(jìn)行作用的。