周美宏，馮旭鳳，吳佩杉，于 淇，韋亞寧，孔令棟

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥工程學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；5.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067）

銅離子是生物體必需的微量元素[1]，但過量攝入銅也會(huì)產(chǎn)生危害[2]，人體內(nèi)過量積累Cu2+時(shí)，會(huì)引發(fā)肝臟的病變或者兒童肝硬化，，Wilson以及Alzheimer等[3-4]。目前許多方法可以用來檢測(cè)Cu2+，如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)及電感耦合等離子質(zhì)譜法 (ICP-MS)等[5]。在這些檢測(cè)方法中，熒光檢測(cè)法由于具有易操作、高靈敏、快速響應(yīng)以及無損傷等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一項(xiàng)有效的檢測(cè)手段[4]。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 有機(jī)熒光探針的合成

1）參考文獻(xiàn)[7]方法，合成化合物1和2。

化合物1的合成：取1.2g羅丹明B，加入30ml無水乙醇。取3mL 80%的水合肼，逐滴加入，攪拌混合。95°C加熱、磁力攪拌，回流4h。溶液由深紫色溶液變?yōu)槌吻宓壬芤?，減壓抽濾。加入50mL 1mol/L HCl后變成紅色溶液。逐滴加入1mol/L NaOH，析出大量乳白色絮狀沉淀，pH調(diào)到9～10。將產(chǎn)生的沉淀減壓抽濾，15mL蒸餾水清洗3次，紅外干燥。得粉紅色固體。

化合物2的合成：取0.461g化合物1，加入20mL無水乙醇。逐滴加入700μL，30%的乙二醛溶液，室溫?cái)嚢?h。紅外干燥，得到淡黃色固體。

2） 有機(jī)熒光探針的合成。取 0.248g化合物2分別與0.1g 3-甲氧基苯酰肼和0.0915g水楊酰肼反應(yīng)，倒入30mL無水乙醇，超聲溶解。氮?dú)獗Ｗo(hù)下80°C加熱、磁力攪拌，回流6h。減壓抽濾，紅外快速干燥，得紅褐色固體。

1.2 溶液的配制

1）配制Tris三（羥甲基）氨基甲烷緩沖溶液。

取1.2114 g三（羥甲基） 氨基甲烷，8.9998gNaCl，倒入體積比2:3乙醇水溶液溶解，鹽酸調(diào)pH到7.4。

2） 配制 1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2，儲(chǔ)備液和Cu2+及各種金屬離子（Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Ca2+、Co2+）溶液，實(shí)驗(yàn)過程中稀釋成相應(yīng)濃度備用。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紫外-可見吸收光譜

將1.0×10-3mol/L的熒光探針Rh1、Rh2儲(chǔ)備液稀釋到5.0×10-5mol/L，金屬離子溶液稀釋到1.0×10-5mol/L。取 500微升 5.0×10-5mol/L 的熒光探針Rh1、Rh2與金屬離子溶液混合進(jìn)行紫外-可見光譜測(cè)試。當(dāng)加入銅離子后紫外-可見吸收光譜在558 nm和559 nm處的吸收有顯著地增加，表明Cu2+與Rh1、Rh2有較好的結(jié)合。然而當(dāng)將 Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+其紫外-可見吸收光譜幾乎未有任何變化。

1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2對(duì) 0～50μmol/L的銅離子進(jìn)行檢測(cè)。在乙醇水溶液 [2∶3（體積比），50mm Tris-HCl無EDTA，pH7.4]中，隨著銅離子濃度的增加，探針分子的紫外-可見吸收越來越強(qiáng)。

2.2 熒光光譜響應(yīng)

1） 將1.0×10-3mol/L的熒光探針Rh1、Rh2儲(chǔ)備液稀釋到5.0×10-5mol/L，金屬離子溶液稀釋到1.0×10-5mol/L。取 500μL 5.0×10-5mol/L 的熒光探針Rh1、Rh2與金屬離子溶液混合，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。Ag+、Pb2+、Na+、Cd2+、Ba2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+其熒光響應(yīng)較弱，加入Cu2+后熒光顯著增強(qiáng)。

2）熒光探針Rh1、Rh2對(duì)不同濃度銅離子的熒光光譜響應(yīng)。

1.0×10-3mol/L的熒光探針 Rh1、Rh2對(duì) 0～50μmol/L的銅離子進(jìn)行熒光檢測(cè)。在乙醇水溶液 [2∶3（體積比），50mm Tris-HCl無 EDTA，pH7.4]中，隨著銅離子濃度的增加，探針分子的熒光吸收越來越強(qiáng)。見圖1、圖2。

3 討論

圖1 探針Rh1對(duì)不同濃度銅離子的熒光響應(yīng)

圖2 探針Rh2對(duì)不同濃度銅離子的熒光響應(yīng)

本實(shí)驗(yàn)中我們基于羅丹明B與3-甲氧基苯酰肼合成探針Rh1以及與水楊酰肼合成探針Rh2。在400～700 nm范圍內(nèi)其它金屬離子紫外-可見吸收非常微弱。在加入Cu2+后，熒光探針Rh1在559nm處，Rh2在558nm處有較大吸收峰值。熒光探針Rh1、Rh2對(duì)銅離子的熒光光譜響應(yīng)中，探針Rh1、Rh2在560nm處有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，其它金屬離子熒光強(qiáng)度非常弱，表現(xiàn)出對(duì)Cu2+較好的選擇性。隨著Cu2+濃度的增加，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，顯示出選擇性的、敏感的熒光增強(qiáng)反應(yīng)。