王裴林, 周利利, 梁成真, 孟志剛, 郭三堆, 張 銳

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供了能量。細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量95%來自線粒體，所以其又有“細(xì)胞動(dòng)力工廠”之稱[1]。除了為細(xì)胞供能外，線粒體還參與諸如細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，并有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。因此，線粒體基因組中基因的異常表達(dá)常常會(huì)影響細(xì)胞的能量代謝，從而引發(fā)一系列的表型變化，如抗病性降低或細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生等。對(duì)線粒體基因組編碼基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，有利于深入研究細(xì)胞質(zhì)基因的功能以及某些與細(xì)胞質(zhì)關(guān)聯(lián)性狀的分子機(jī)理。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是由細(xì)胞質(zhì)基因控制的并可被核恢復(fù)基因抑制的母性遺傳性狀。近幾年，棉花功能基因組學(xué)進(jìn)展良好，但棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理的相關(guān)研究報(bào)道不是很多，尤其是胞質(zhì)不育的機(jī)理，尚缺乏足夠的分子生物學(xué)證據(jù)[1,2]?；谀壳暗难芯窟M(jìn)展，多數(shù)科學(xué)家認(rèn)為CMS不育發(fā)生的原因大多是由于線粒體基因的重組重排導(dǎo)致，所以對(duì)線粒體基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的獲得顯得尤為重要。

在傳統(tǒng)方法中，cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法往往被用于精確定位RNA分子的5′或3′末端，但由于線粒體基因大部分不存在轉(zhuǎn)錄后加工的過程，即不會(huì)在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行5′加帽子結(jié)構(gòu)和3′端加polyA序列，也沒有內(nèi)含子，而是采用邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯的方式，所以不適用于RACE技術(shù)。為克服這一弊端，Kuhn和Binder于2002年提出環(huán)式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(cyclic reverse transcription polymerase chain reaction, cRT-PCR)，該技術(shù)極大簡(jiǎn)化了操作步驟，成功實(shí)現(xiàn)一次性確定目的RNA的5′和3′末端的設(shè)想，具有明顯的高效與便捷性[3]。

cRT-PCR技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)該用于確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子、鑒定核糖體RNA前體的5′和3′末端以及評(píng)估成熟mRNA的3′末端的長(zhǎng)度和轉(zhuǎn)錄后延伸。目前，cRT-PCR技術(shù)應(yīng)用于水稻和擬南芥等植物的細(xì)胞基因研究，但研究報(bào)道中均是利用該方法對(duì)特異基因進(jìn)行研究[4,5]，尚未見從轉(zhuǎn)錄組的水平獲得全部線粒體基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的應(yīng)用。

目前，根據(jù)諸多的文獻(xiàn)報(bào)道,CMS基因通常有以下五種特點(diǎn)：①不同的CMS之間通常不具備同源性；②CMS的位點(diǎn)經(jīng)常出現(xiàn)在ATP基因的上下游；③它們往往通過重組產(chǎn)生嵌合的ORF；④CMS編碼的蛋白通常具有細(xì)胞毒性；⑤CMS編碼蛋白通常會(huì)形成跨膜結(jié)構(gòu)域。尤其是嵌合ORF的形成是不育基因目前的重點(diǎn)研究方向，通過cRT-PCR技術(shù)可以較為簡(jiǎn)單的獲得靶標(biāo)基因的UTR區(qū)，為尋找嵌合的ORF提供了一個(gè)新的方向[6～8]。

近幾年棉花功能基因組學(xué)進(jìn)展良好，但棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理的相關(guān)研究報(bào)道不是很多，同其他作物雄性不育機(jī)理研究相比有所滯后。因此，我們希望通過該方法的改良及應(yīng)用能為尋找不育基因帶來新的方法。本研究在獲得高質(zhì)量RNA的基礎(chǔ)上，對(duì)RNA進(jìn)行高效環(huán)化，并通過隨機(jī)引物對(duì)線粒體全基因組基因進(jìn)行cRT-PCR，獲得了全部線粒體基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，并以ATP6基因?yàn)槔?，比較了利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行cRT-PCR后所獲得的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的差異。棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究對(duì)于更好地利用棉花雜種優(yōu)勢(shì)，以及加深對(duì)植物不育機(jī)理的認(rèn)識(shí)，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)所用材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院抗蟲棉課題組實(shí)驗(yàn)室培育的不育系P30A。

1.1.2試劑 原平皓RNA提取試劑盒、RNA酶抑制劑、DNA酶、Superstar max超保真mix購自Genestar公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金生物科技有限公司；T4 RNA連接酶購自Promega公司；DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen生化科技有限公司；T載體、感受態(tài)購自擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；高溫滅菌冷卻至室溫的DEPC水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) ①RT-PCR引物使用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的PrimerServer: PCR Primers Batch Design & Specificity Check引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站[9]，對(duì)參考基因序列設(shè)計(jì)普通引物，引物位置在參考序列兩邊留出100～300 bp為宜，并由網(wǎng)站檢測(cè)為特異引物。

②cRT-PCR引物由RT-PCR引物反向互補(bǔ)得到，估計(jì)其大小，約為原始序列兩邊預(yù)留的200 bp加上可能的UTR區(qū)域(約100～600 bp)(表1)。

1.2.2RNA提取 按照原平皓試劑盒RNA提取說明書提取RNA，并在加入去蛋白液前增加DNA酶，去除DNA，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)去除DNA污染。提取完成后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整度；并通過Nano-drop對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)量。

表1 4類線粒體基因cRT-PCR引物信息Table1 Four gene families mitochondrial gene cRT-PCR primer information.

1.2.3RNA環(huán)化 體系：10 μg總RNA，1 μL RNA酶抑制劑，2 μL T4 RNA連接酶Buffer，1 μL T4 RNA連接酶，1 μL ATP， DEPC水補(bǔ)足至20 μL。將混合好的樣品置于金屬浴上，16℃連接過夜。在連接液的每管中加入10 μL 氯仿并用移液器反復(fù)吹打；加入100 μL無水乙醇移液器吹打混勻，冰浴15 min；將混合物12 000 r/min，10 min離心，棄上清；最后，加入14 μL DEPC水溶解[11,12]。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄 按照全式金生物科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，完成后用Nano測(cè)定濃度，ddH2O稀釋至終濃度200 ng/μL ，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5cRT-PCR程序 我們?cè)诿藁ň€粒體基因的主要4種類型的基因ATP、COX、RPS、NAD基因中隨機(jī)選擇7個(gè)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并根據(jù)普通PCR引物反向互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)相應(yīng)的cRT-PCR引物，其特點(diǎn)是僅能以環(huán)化RNA為模板獲得擴(kuò)增條帶。擴(kuò)增體系：25 μL Superstar max超保真mix(Genestar)，1 μL cDNA，正反向引物各1 μL，ddH2O 22 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；54℃(取決于引物)退火30 s，72℃延伸40 s，35～40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。完成PCR之后，將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中上樣，120 V，30 min。電泳結(jié)束后，按照DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen生化科技有限公司)回收條帶。

1.2.6ATP6的測(cè)序分析 為進(jìn)一步分析測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從上述7個(gè)棉花線粒體基因中隨機(jī)選取ATP6為代表進(jìn)行分析。對(duì)ATP6基因的cRT-PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后將該序列回收后連接T載體，挑單克隆進(jìn)行測(cè)序，最終挑選出一個(gè)一致性最好的克隆子進(jìn)行分析，并與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì)。然后采用隨機(jī)引物和特異引物共同對(duì)其進(jìn)行cRT-PCR(圖1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因cRT-PCR電泳分析

對(duì)棉花線粒體基因的主要4種類型的基因中隨機(jī)選擇的7個(gè)基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，7個(gè)線粒體基因的電泳條帶清晰(圖2)，表明RNA模板已經(jīng)環(huán)化，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析提供必要的前提。

圖1 隨機(jī)引物和特異引物ATP6全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本對(duì)比Fig.1 Comparison of random primer and specific primer ofATP6gene full-length transcript.

我們對(duì)棉花線粒體的33編碼蛋白基因(ATP1、ATP4、ATP6、ATP8、ATP9；COX1、COX2、COX3；RPL2、RPL5、RPL10、RPL16；NAD3、NAD4、NAD4L、NAD6、NAD7、NAD9；RPS3、RPS4、RPS7、RPS10、RPS12、RPS14；CCMB、CCMC、CCMFC、CCMFN；SDH3、SDH4；MATR、COB、MTTB)進(jìn)行了cRT-PCR，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的基因UTR都在300～500 bp左右。我們使用特異引物和隨機(jī)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)兩者所獲得結(jié)果基本保持一致，通過測(cè)序驗(yàn)證，僅有個(gè)別基因出現(xiàn)了極少數(shù)的SNP。

圖2 線粒體基因cRT-PCR電泳分析Fig.2 Analysis of mitochondrial gene by cRT-PCR.

2.2 ATP6基因測(cè)序結(jié)果分析

通過ATP6基因的cRT-PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一段全長(zhǎng)567 bp的序列(圖3)，測(cè)序并與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì)，我們獲得了284 bp的5′UTR和22 bp的3′UTR，并且原基因上的一段重復(fù)區(qū)域也完全匹配，獲得了ATP6的完整全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。測(cè)序結(jié)果與參考序列保持一致，之后，采用隨機(jī)引物和特異引物共同對(duì)其進(jìn)行cRT-PCR，發(fā)現(xiàn)兩者獲得條帶一致。測(cè)序后，兩者序列僅出現(xiàn)了一個(gè)SNP。其余基因驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果同樣保持一致，所以我們認(rèn)為采用隨機(jī)引物替代靶基因特異引物的方法在保證了正確率的情況下，更為方便快速。

圖3 ATP6基因cRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 cRT-PCR results ofATP6gene.注：M：Marker；1，2：隨機(jī)引物；3，4：特異引物。

綜上所述，通過隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cRT-PCR同特異引物一樣能獲得目的基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，但在比對(duì)序列時(shí)也發(fā)現(xiàn)極少部分基因的測(cè)序結(jié)果存在基因的不完整性和突變性，主要表現(xiàn)為基因兩端堿基缺失與單核苷酸多態(tài)性。前者的發(fā)生取決于RNA的完整度以及環(huán)化效率，而單核苷酸多態(tài)性的發(fā)生則多半是由于特異引物和隨機(jī)引物的差異造成的。因此，在方便快捷的基礎(chǔ)上，首先采用隨機(jī)引物對(duì)大批量的基因進(jìn)行cRT-PCR，如若所獲基因轉(zhuǎn)錄本的序列異常，為保證準(zhǔn)確性，可輔助設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2.3 cRT-PCR在尋找不育基因中的應(yīng)用

通過對(duì)本課題組繁育的不育系和保持系同時(shí)進(jìn)行線粒體基因的批量cRT-PCR，根據(jù)條帶大小以及測(cè)序結(jié)果對(duì)線粒體編碼蛋白基因進(jìn)行考量，找到一些具有差異的候選基因，認(rèn)為可能是嵌合ORF的插入導(dǎo)致了結(jié)果的差異。

如圖4所示，差異表達(dá)出現(xiàn)了四種情況，一是不育系和保持系條帶完全一致；二是不育系和保持系條帶存在明暗亮度差異；三是不育系有而保持系沒有條帶；四是在不育系和保持系中條帶大小不一致的情況。

另外有的基因在電泳條帶上表現(xiàn)一致，但通過測(cè)序出現(xiàn)了幾個(gè)氨基酸的缺失，或是出現(xiàn)一些SNP的情況，結(jié)果如表2所示： 線粒體編碼蛋白基因中ATP1、ATP4、ATP6、COX1在不育系和保持系的擴(kuò)增中出現(xiàn)了明顯差異，尤其是ATP1、ATP6、COX1，在兩段序列中出現(xiàn)了大段的插入或者缺失，我們認(rèn)為這些差異片段可能是由于線粒體的某種重組或者重排造成，或可能引起作物的不育。除此之外，線粒體的其他基因ATP8、COX2、NAD3等出現(xiàn)了在不育系和保持系中序列有SNP的情況，可能是由于PCR或者測(cè)序的原因，也有可能是線粒體的某種突變引起，但這種方式引起不育的可能性過低。

圖4 線粒體基因在不育系與保持系中的擴(kuò)增條帶Fig.4 Amplification bands of mitochondrial genes in sterile line and maintainer line.注：A：ATP8；B：COX2；C：ATP1；D：ATP6；M：Marker；A系：不育系；B系：保持系。

基因名稱差異情況基因名稱差異情況ATP1A系260 bp,B系沒有RPS3SNPATP4A系:5′-AACGCGTTTAGGTAAGACTT-3′B系:5′-AAC--G---A-------CTT-3′RPS4RPS7-ATP6A系360 bp,B系526 bp,SNPRPS10SNPATP8SNPRPS12-ATP9-RPS14SNPCOX1A系B系161 bp序列差異,SNPCCMB-COX2SNPCCMCSNPCOX3-CCMFC-NAD3SNPCCMFNSNPNAD4-SDH3SNPNAD4LSNPSDH4未獲條帶NAD6-MATRSNPNAD7SNPCOB未獲條帶NAD9SNPMTTBSNP

3 討論

長(zhǎng)期以來，cRT-PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻等植物的細(xì)胞研究中，但鮮有涉及棉花細(xì)胞線粒體基因的研究。在本研究中，我們對(duì)轉(zhuǎn)錄本序列分析發(fā)現(xiàn)，cRT-PCR技術(shù)適用于獲得棉花線粒體目的基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，為后續(xù)技術(shù)改良奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在傳統(tǒng)cRT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，我們優(yōu)化了RNA提取方法和環(huán)化連接體系，顯著提高了環(huán)化效率。反轉(zhuǎn)錄階段，在保證與特異引物獲得相同完整轉(zhuǎn)錄本的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地采用隨機(jī)引物進(jìn)行大批量的基因檢測(cè)，操作更方便快捷。

基于本研究中改良的cRT-PCR技術(shù)存在上述提及的基因的不完整性和突變性現(xiàn)象，本研究提出如下針對(duì)性措施：首先保證RNA提取方法的科學(xué)準(zhǔn)確性，鑒于RNA的降解起始于5′和3′末端，直接決定環(huán)化效率并影響擴(kuò)增中基因序列的完整性，因此反應(yīng)試劑中應(yīng)保證一定濃度的RNA酶抑制劑，以從源頭上確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性；其次，我們發(fā)現(xiàn)環(huán)化的效率極大的影響了擴(kuò)增的結(jié)果，無論是特異引物還是隨機(jī)引物，都會(huì)出現(xiàn)區(qū)段缺失的情況，但在必要時(shí)將隨機(jī)引物改為傳統(tǒng)的特異性引物，以從反應(yīng)途徑上確保降低單核苷酸多態(tài)性的發(fā)生，從而提升基因序列的特異性。在本研究中，需要綜合考慮影響實(shí)驗(yàn)的諸多環(huán)節(jié)，其中需要格外關(guān)注的是RNA環(huán)化連接的質(zhì)量。過夜可以為充分環(huán)化提供必要的時(shí)間保障，但鑒于單鏈RNA的易降解性，保證充分環(huán)化時(shí)間的前提是確保所加入的RNA酶抑制劑達(dá)到一定濃度，能夠保障RNA在環(huán)化期間的穩(wěn)定性。此外，在過夜后環(huán)化效率依然不高的特殊情形下，加入適量ATP可以明顯加速RNA環(huán)化，提高環(huán)化效率。

我們通過改良的cRT-PCR技術(shù)對(duì)不育基因進(jìn)行探索，通過對(duì)不育系和保持系的擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在ATP和COX家族中存在UTR區(qū)有差異的基因(在其他線粒體基因中大多是SNP的差異)。在此，我們暫不討論條帶明暗的差異，這可能和擴(kuò)增效率或是拷貝數(shù)相關(guān)。差異基因中有無的差異、條帶大小的差異，都很可能是由于線粒體內(nèi)部重排或者ORF的插入導(dǎo)致的，而這些差異可能會(huì)引起作物的CMS。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)線粒體編碼蛋白基因中ATP1、ATP4、ATP6、COX1在不育系和保持系的擴(kuò)增中出現(xiàn)了明顯差異，我們認(rèn)為這些差異片段可能是由于某種重組或者插入造成，或可能引起作物的不育。UTR區(qū)段的差異傾向于ATP和COX基因，這和目前發(fā)表的CMS相關(guān)文獻(xiàn)保持一致，提升了作為CMS相關(guān)基因的可能性，因此我們認(rèn)為該方法用來尋找不育基因是可行的。當(dāng)然，這些差異的出現(xiàn)不一定是CMS基因造成的嵌合ORF，具體結(jié)果如何還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是，通過cRT-PCR技術(shù)，為尋找CMS基因提供了新的方法和思路。