王 偉1,， 王明春， 任 洪， 張開(kāi)武， 趙德剛1,， 楊文鵬

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽(yáng) 550006)

玉米是主要的飼料和糧食作物，品質(zhì)直接影響人畜禽的健康發(fā)育和食用口感。蛋白質(zhì)中的賴氨酸是人畜禽等單胃動(dòng)物必需的氨基酸，淀粉中的支鏈淀粉含量與食用品質(zhì)緊密相關(guān)。普通玉米賴氨酸含量較低(0.3%以下)，不能滿足人類食用和食品加工的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)要求(0.5%以上)[1]。Mertz等發(fā)現(xiàn)，o2(opaque2)突變能顯著提高玉米籽粒胚乳中的賴氨酸含量(0.37%)[2]。糯玉米(waxy1，wx1)食味品質(zhì)優(yōu)良，最早在中國(guó)發(fā)現(xiàn)[3]，Collins[4]于1909年首次描述了糯玉米的特征特性，其籽粒胚乳暗淡、表面光滑、呈蠟狀，其胚乳含95%～100%的支鏈淀粉，是由遺傳漂變引起的胚乳突變[5-9]。但其賴氨酸含量卻不夠高(0.24～0.34%)[10]，不能滿足人類食用和食品加工的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)要求。為提高糯玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，P.S.Misra等[11]首先進(jìn)行了wx和o2基因的聚合，張述寬等[12]利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)，獲得了18個(gè)含有wx和o2基因的優(yōu)質(zhì)蛋白糯玉米自交系，其賴氨酸為0.36%～0.54%，比原始親本增加了1.15%～27.06%。Yang等[13]聚合了opaque16(o16)和wx基因，得到了13個(gè)家系，其賴氨酸含量比糯玉米系提高了16%以上。

高賴氨酸基因o2、o16與糯性基因(wx)聚合，可以提高玉米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和食用品質(zhì)[14]，但玉米o(hù)2、o16和wx基因聚合提高玉米籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的分子機(jī)理迄今未知。項(xiàng)目組經(jīng)過(guò)幾年的努力，采用回交育種和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)構(gòu)建了o2o2o16o16wxwx-NIL,o2o2o16o16-NIL,o2o2wxwx-NIL,o16o16wxwx-NIL，o2o2-NIL，wxwx-NIL和o16o16-NIL共7種不同基因型的BC 6 F 4世代近等基因系材料，有必要對(duì)其油分，淀粉、蛋白質(zhì)和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行分析，為其遺傳研究及其在育種上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以玉米o(hù)2、o16和wx三隱性基因聚合系QCL 8002-11為供體，普通玉米自交系CML 539為受體選育的o2o2o16o16wxwx-NIL，o2o2o16o16-NIL，o2o2wxwx-NIL，o16o16wxwx-NIL，o2o2-NIL，wxwx-NIL和o16o16-NIL共7種不同基因型的BC 6 F 4家系，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所選育，簡(jiǎn)化表示為o2o16wx-NIL，o2o16-NIL,o2wx-NIL，o16wx-NIL，o2-NIL，wx-NIL和o16-NIL共7種不同組合類型，其中o2o16wx-NIL,o2o16-NIL，o2wx-NIL，o16wx-NIL為o2、o16和wx基因不同聚合類型近等基因系。

1.2 方 法

利用福斯(FOSS)公司的谷物分析儀(InfratecTM 1241 Grain Analyzer,Made in Sweden)進(jìn)行籽粒油分、總淀粉和蛋白質(zhì)含量分析。

利用全自動(dòng)氨基酸分析儀(S-433 D，Sykam，Germany)分析天冬氨酸(aspartate,Asp)、蘇氨酸(threonine,Thr)、絲氨酸(serine,Ser)、谷氨酸(glutamate,Glu)、甘氨酸(glycine,Gly)、丙氨酸(alanine,Ala)、半胱氨酸(cysteine,Cys)、纈氨酸(valine,Val)、甲硫氨酸(methionine,Met)、異亮氨酸(isoleucine,Ile)、亮氨酸(leucine,Leu)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phr)、組氨酸(histidine,His)、賴氨酸(lysine,Lys)、精氨酸(arginine,Arg)和脯氨酸(proline,Pro)共17種游離氨基酸(free amino acid,FAA)含量。

具體過(guò)程如下：樣品干燥后，利用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)FW 80(天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))磨成粉狀，利用60～80目篩子篩選。準(zhǔn)確稱量過(guò)篩的樣品120～150 mg，于20 mL帶蓋玻璃試管中。加入5 mL 6 mol/L HCl，110 ℃水解24 h。冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用蒸餾水仔細(xì)沖洗試管。利用6 mol/L NaOH調(diào)pH至2.0后，定容至100 mL，混勻后靜置。轉(zhuǎn)移至一次性杯子中，利用注射器吸取樣品液，加上0.45μm水系針式過(guò)濾器后，過(guò)濾轉(zhuǎn)移至液相色譜進(jìn)樣瓶(2 mL clear screw vial with patch Borosilicate，寧波哈邁儀器科技有限公司)中，上機(jī)檢測(cè)17種游離氨基酸含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

表1 玉米o(hù)2、o16和wx基因不同組合類型近等基因系的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

編號(hào)名稱基因型油分/%淀粉/%蛋白質(zhì)/%RB1QCL8013-1o2o2o16o16wxwx5.7868.1310.49RB2QCL8013-2o2o2o16o165.6567.6010.55RB3QCL8013-3o2o2wxwx6.1067.6510.00RB4QCL8013-4o16o16wxwx5.0868.2011.70RB5QCL8013-5o2o25.8167.4510.00RB6QCL8013-6wxwx4.6269.0011.73RB7QCL8013-7o16o165.2668.2210.02RB8CML539n5.1968.1310.65

注：n表示正常籽粒。

圖1 玉米o(hù)2o16wx、o2o16、o2wx、o16wx近等基因系和輪回親本氨基酸含量

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒油分含量分析

與輪回親本CML 539相比，QCL 8013-1(o2o16wx-NIL)籽粒油分含量提高了11.37%，QCL 8013-2(o2o16-NIL)籽粒油分含量提高了8.86%，QCL 8013-3(o2wx-NIL)籽粒油分含量提高了17.53%，QCL 8013-5(o2-NIL)籽粒油分含量提高了11.95%(表1)。

2.2 籽?？偟矸酆糠治?/h3>

與輪回親本CML 539相比，QCL 8013-3(o2wx-NIL)籽粒淀粉含量降低了0.71%，QCL 8013-5(o2-NIL)籽粒淀粉含量降低了1.00%，QCL 8013-1(o2o16wx-NIL)、QCL 8013-2(o2o16-NIL)、QCL 8013-4(o16wx-NIL)、QCL 8013-6(wx-NIL)和QCL 8013-7(o16-NIL)籽粒淀粉含量沒(méi)有顯著變化(表1)。

2.3 籽粒蛋白質(zhì)含量分析

與輪回親本CML 539相比，QCL 8013-3(o2wx-NIL)籽粒蛋白質(zhì)含量降低了6.03%，QCL 8013-4(o16wx-NIL)籽粒蛋白質(zhì)含量提高了9.91%，QCL 8013-5(o2-NIL)籽粒蛋白質(zhì)含量降低了6.05%，QCL 8013-6(wx-NIL)籽粒蛋白質(zhì)含量提高了10.22%，QCL 8013-7(o16-NIL)近等基因系蛋白質(zhì)含量降低了5.87%(表1)。

2.4 籽粒氨基酸含量分析

與輪回親本CML 539相比，QCL 8013-1(o2o16wx-NIL)中Asp、Gly、Ala、Met、Leu、Lys和Arg 等7種氨基酸發(fā)生顯著變化，其中，Asp、Gly、Lys和Arg分別增加了39.11%、43.24%、111.22%和62.51%，Ala、Met和Leu分別減少了25.21%、29.67%和43.89%。QCL 8013-2(o2o16-NIL)中7種氨基酸均有不同程度的變化。其中，Asp、Gly、Lys和Arg分別增加了31.10%、32.89%、109.53%和54.98%，Ala、Met和Leu分別減少了27.76%、41.04%和44.98%。QCL 8013-3(o2wx-NIL)中Asp、Gly、Ala、Met、Leu、Phe、Lys和Arg等8種氨基酸均有不同程度的變化。其中，Asp、Gly、Lys和Arg含量分別增加了26.60%、24.75%、91.22%和38.26%，Ala、Met、Leu和Phe分別減少了34.04%、49.50%、51.07%和29.03%。QCL 8013-4(o2wxo16wx-NIL)中Met含量減少了57.26%，Lys含量增加了34.40%(圖1，表2)。

與輪回親本CML 539相比，QCL 8013-5(o2-NIL)中Glu、Gly、Ala、Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys、Arg和Pro等11種氨基酸均有不同程度的變化。其中，Glu、Ala、Met、Ile、Leu、Phe、His、Pro分別減少了39.33%、38.77%、59.15%、34.59%、53.67%、32.35%和13.20%、-30.92%，Gly、Lys和Arg分別增加了15.14%、79.93%和31.21%。QCL 8013-6(wx-NIL)中Lys增加了29.69%。QCL 8013-7(o16-NIL)中Glu、Gly、Ala、Leu、Phe、His、Lys、Arg和Pro等9種氨基酸均有不同程度的變化。其中，Glu、Ala、Leu、Phe、His和Pro分別減少了37.77%、38.54%、54.81%、36.87%、13.95%和27.85%。Gly、Lys和Arg分別增加了15.31%、70.11%和26.94%(圖2)。

表2 玉米o(hù)2、o16和wx基因不同組合類型近等基因系的氨基酸含量

17FAAs/%CML539o2o16wx-NILo2o16-NILo2wx-NILo16wx-NILo2-NILwx-NILo16-NILAsp0.630.870.820.790.620.740.590.75Thr0.390.410.410.380.370.350.350.34Ser0.510.490.470.440.500.400.480.41Glu2.231.671.571.502.011.351.911.39Gly0.360.520.480.450.370.420.350.42Ala0.830.620.600.550.730.510.700.51Cys0.070.070.060.050.050.050.060.06Val0.490.510.500.460.450.420.420.40Met0.080.060.050.040.030.030.060.06Ile0.360.300.290.270.300.240.290.24Leu1.510.850.830.741.240.701.200.68Tyr0.250.250.240.250.250.210.250.20Phe0.530.420.430.380.480.360.470.34His0.330.340.320.310.300.290.300.29Lys0.230.480.480.430.310.410.290.39Agr0.360.580.560.500.360.470.360.46Pro1.070.930.890.850.950.740.980.77

圖2 玉米o(hù)2、o16、wx近等基因系和輪回親本17種氨基酸含量

3 結(jié)論與討論

本研究以o2o16wx-NIL,o2o16-NIL,o2wx-NIL,o16wx-NIL，o2-NIL，wx-NIL和o16-NIL共7種基因型BC 6 F 4家系及其輪回親本為材料，進(jìn)行籽粒油分、總淀粉、蛋白質(zhì)和氨基酸含量分析。與輪回親本CML 539相比，o2o16wx-NIL、o2o16-NIL、o2wx-NIL和o2-NIL籽粒油分含量提高了8%以上。o2wx-NIL和o2-NIL籽粒淀粉含量分別降低了0.7%以上。o16wx-NIL和wx-NIL蛋白質(zhì)含量分別提高了9.91%和10.22%，o2wx-NIL、o2-NIL和o16-NIL蛋白質(zhì)含量分別降低了6.03%、6.05%和5.87%。o2o16wx-NIL,o2o16-NIL,o2wx-NIL,o16wx-NIL，o2-NIL、wx-NIL和o16-NIL氨基酸含量均發(fā)生不同程度變化，其中，Lys分別增加了111.22%、109.53%、91.22%、34.40%、79.93%、29.69%和70.11%。

楊文鵬等[15]利用高賴氨酸突變o2系太系19 和o16系QCL 3021、QCL 3024為供體材料，普通玉米自交系QCL 2179和QCL 2180為受體材料，利用回交育種技術(shù)，選育了一批玉米高賴氨酸突變o2和o16近等基因系材料，其o2近等基因系籽粒的賴氨酸、油分、蛋白質(zhì)和淀粉平均含量分別提高了22%、15%、16%和1.7%。o16近等基因系不透明籽粒的賴氨酸、油分、蛋白質(zhì)和淀粉平均含量分別提高了21%、18%、-16%和1.5%。張曉星等[16]利用優(yōu)質(zhì)蛋白玉米CA 339和魯2548自交系為供體，25個(gè)品質(zhì)較好的糯玉米自交系為受體，利用分子標(biāo)記選擇技術(shù)，創(chuàng)制出了5套糯玉米o(hù)paque2近等基因系材料，其賴氨酸含量比其輪回親本分別提高了59.0%、52.7%、48.5%、46.3%和61.9%。譚華等[17]利用24份來(lái)自不同遺傳背景普通玉米自交系為受體，6份來(lái)自CIMMYT(國(guó)際玉米小麥改良中心)的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米(Quality Protein Maize，QPM)自交系為o2基因供體，利用回交轉(zhuǎn)育將o2基因?qū)氲绞荏w中，獲得的QPM近等基因系，賴氨酸含量為0.36%～0.42%，與相應(yīng)的受體親本相比，賴氨酸含量增加9.1%～64%。我們對(duì)前期獲得的o2o16wx-NIL、o2o16-NIL、o2wx-NIL、o16wx-NIL、o2-NIL、wx-NIL和o16-NIL共7種基因型的BC 6 F 4世代近等基因系進(jìn)行品質(zhì)分析，不僅篩選出優(yōu)異品質(zhì)材料，而且可為探究?jī)?yōu)異基因聚合提高玉米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的機(jī)理提供研究材料。