王成華，劉露希，邵寶林，張 婧

(四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心/國(guó)家稻種檢疫及種質(zhì)鑒定檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品安全檢測(cè)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

1 前言

近年來(lái)，隨著糧食國(guó)際貿(mào)易的不斷發(fā)展，我國(guó)進(jìn)境糧食貿(mào)易量也快速增長(zhǎng)。四川是全國(guó)13個(gè)糧食主產(chǎn)區(qū)之一，由于種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和對(duì)不同種類糧食的需求，四川進(jìn)口糧食逐年增加。2014年底瀘州、宜賓進(jìn)境糧食指定口岸的開(kāi)檢運(yùn)行，四川成為我國(guó)西部地區(qū)進(jìn)境糧食重要集散地。2015年以來(lái)，2個(gè)口岸進(jìn)境糧食數(shù)量、批次分別從2015年的4.23萬(wàn)t、72批次升至2017年的9.17萬(wàn)t、161批次，升幅分別達(dá)116.8%和123.6%，2018年1～10月進(jìn)境糧食達(dá)6.2萬(wàn)t，詳見(jiàn)表1。

隨著進(jìn)境糧食數(shù)量、種類和批次的增長(zhǎng)，外來(lái)有害生物入侵、轉(zhuǎn)基因安全和糧食中有毒有害物質(zhì)等方面的風(fēng)險(xiǎn)與日俱增，特別是檢出外來(lái)雜草種類和批次也大幅增長(zhǎng),對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅。種子生活力強(qiáng)弱是確定其侵染力的重要指標(biāo)，為防止外來(lái)有害雜草在國(guó)內(nèi)入侵、定殖和擴(kuò)散，以及轉(zhuǎn)基因玉米、大豆轉(zhuǎn)基因逃逸造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)截獲的綠穗莧、鬼針草和牽牛等外來(lái)雜草種子及轉(zhuǎn)基因玉米、大豆進(jìn)行生活力測(cè)定研究，結(jié)果可為進(jìn)境糧食口岸檢疫及除害處理提供技術(shù)支撐。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 儀器設(shè)備與試驗(yàn)材料

2.1.1 儀器設(shè)備 恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱(品牌Memmert，型號(hào)HPP260)。

2.1.2 用具及耗材 發(fā)芽盒，50mL量筒，鑷子，計(jì)時(shí)器，吸水紙，蒸餾水等。

表1 四川糧食生產(chǎn)及進(jìn)口情況統(tǒng)計(jì)表

2.1.3 試驗(yàn)材料 供試種子由中儲(chǔ)糧成都直屬庫(kù)和中紡糧油四川分公司收集提供，詳見(jiàn)表2。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1.1 溫濕度 設(shè)定22.5℃、25℃和27.5℃等3個(gè)溫度梯度，濕度設(shè)定為85%。

表2 供試種子情況一覽表

2.2.1.2 光照 設(shè)定光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)2個(gè)處理。光照培養(yǎng)為光照/黑暗各12h，黑暗培養(yǎng)為24h全黑暗培養(yǎng)。光照強(qiáng)度5,000Lux。

2.2.1.3 處理 每種供試種子設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)20粒種子。

2.2.2 選材與分樣 選取收集的三葉鬼針草、綠穗莧、裂葉牽牛、轉(zhuǎn)基因玉米及大豆種子，混勻試驗(yàn)樣品，每個(gè)樣品保留約500粒以上作為供試材料。

2.2.3 種子前處理 將供試種子隨機(jī)各取360粒，發(fā)芽盒中加入10～50mL(視種子大小而定)蒸餾水，放入供試種子浸泡2h。

2.2.4 種子擺放 在發(fā)芽盒中放入兩層相應(yīng)大小吸水紙，加蒸餾水充分濕潤(rùn)后倒掉多余的水，隨機(jī)取經(jīng)浸泡的20粒供試種子，用鑷子均勻擺放在1個(gè)發(fā)芽盒內(nèi)，蓋上發(fā)芽盒蓋。

2.2.5 恒溫培養(yǎng) 1個(gè)處理溫度下光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)共用1個(gè)培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)處理的15個(gè)發(fā)芽盒直接放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。相同溫度下全黑暗培養(yǎng)處理的15個(gè)發(fā)芽盒裝入相應(yīng)大小的紙箱中，上放硬紙板防止透光，再蓋上紙箱蓋板保持全黑暗，放入培養(yǎng)箱中。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度、濕度和光照條件設(shè)置后進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.6 試驗(yàn)觀察 每24h觀察1次，以胚根伸出1mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記錄萌發(fā)種子數(shù)并用鑷子將已萌發(fā)種子取出，及時(shí)補(bǔ)水保持發(fā)芽盒內(nèi)濕度，直到再無(wú)種子萌發(fā)為止。

2.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 萌發(fā)勢(shì)及萌發(fā)率計(jì)算方法(鄧朝暉等，2012)：

萌發(fā)勢(shì)=(實(shí)驗(yàn)最初1/3時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

萌發(fā)率=(萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù))×100%

對(duì)各溫度處理下光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)的種子萌發(fā)情況進(jìn)行方差分析。

3 試驗(yàn)分析

3.1 萌發(fā)率與萌發(fā)勢(shì)分析

3種雜草的萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)都保持較高水平，達(dá)到50%以上的萌發(fā)率及大致相同的萌發(fā)勢(shì)；轉(zhuǎn)基因玉米達(dá)到20%的萌發(fā)率，萌發(fā)勢(shì)保持在10%以上；而經(jīng)滅活處理后的轉(zhuǎn)基因大豆仍有最高5%的萌發(fā)率。供試種子萌發(fā)情況詳見(jiàn)表3。

表3 5種供試種子萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)表

序號(hào)試驗(yàn)種子名稱萌發(fā)數(shù)處理種子萌發(fā)力總萌發(fā)粒數(shù)(粒)前1/3時(shí)間萌發(fā)粒數(shù)平均萌發(fā)勢(shì)(%)平均萌發(fā)率(%)25℃333253.355.027.5℃323050.053.3光照培養(yǎng)22.5℃17711.728.325℃15813.325.04轉(zhuǎn)基因玉米27.5℃12711.720.0全黑暗22.5℃161016.726.725℃292745.048.327.5℃252236.741.7光照培養(yǎng)22.5℃323.35.05轉(zhuǎn)基因大豆25℃111.71.727.5℃0000全黑暗22.5℃323.35.025℃211.73.327.5℃111.71.7

3.2 方差分析

對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行溫度和光照二因素試驗(yàn)分析。

3.2.1 鬼針草 鬼針草在光照培養(yǎng)和全黑暗培養(yǎng)處理間差異不顯著，而溫度處理間差異顯著。

表4 鬼針草萌發(fā)與溫度、光照/黑暗處理間分析

表5 鬼針草不同溫度萌發(fā)數(shù)差異顯著性分析

表6 綠穗莧萌發(fā)與溫度、光照/黑暗處理間分析

測(cè)驗(yàn)表明，鬼針草在22.5℃和25℃萌發(fā)率無(wú)顯著差異，但22.5℃和27℃達(dá)到α=0.01顯著差異。鬼針草在22.5℃萌發(fā)率最高。

3.2.2 綠穗莧 綠穗莧在光照培養(yǎng)和全黑暗培養(yǎng)處理間差異不顯著，而溫度處理間差異顯著。

表7 綠穗莧不同溫度萌發(fā)數(shù)差異顯著性分析

綠穗莧萌發(fā)在22.5℃和25℃達(dá)到α=0.01顯著差異，25℃和27℃達(dá)到α=0.01顯著差異，22.5℃和27℃達(dá)到α=0.01顯著差異。綠穗莧在22.5℃萌發(fā)率最高。

3.2.3 裂葉牽牛 裂葉牽牛在溫度處理間及光照培養(yǎng)、全黑暗培養(yǎng)處理間的差異都不顯著。因此不再做進(jìn)一步差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

3.2.4 轉(zhuǎn)基因玉米 轉(zhuǎn)基因玉米在溫度處理間及溫度×光照/黑暗處理間的差異顯著。

表8 裂葉牽牛萌發(fā)與溫度、光照/黑暗處理間分析

表9 轉(zhuǎn)基因玉米萌發(fā)與溫度、光照/黑暗處理間分析

表10 轉(zhuǎn)基因玉米不同溫度種子萌發(fā)數(shù)差異顯著性分析

差異顯著性測(cè)驗(yàn)

A.溫度處理間分析

轉(zhuǎn)基因玉米萌發(fā)在22.5℃和25℃達(dá)到α=0.05顯著差異，25℃和27℃達(dá)到α=0.05顯著差異,22.5℃和27℃之間無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)基因玉米在25℃萌發(fā)率最高。B.溫度×光照/黑暗培養(yǎng)處理間分析測(cè)驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)基因玉米在光照培養(yǎng)時(shí)，3個(gè)溫度條件下的種子萌發(fā)差異不顯著；在黑暗培養(yǎng)時(shí)，22.5℃和25℃達(dá)到α=0.01顯著差異，22.5℃和27℃達(dá)到α=0.05顯著差異，25℃和27℃之間無(wú)顯著差異。

因此，轉(zhuǎn)基因玉米在黑暗環(huán)境、溫度25℃培養(yǎng)萌發(fā)率最高。

3.2.5 轉(zhuǎn)基因大豆 轉(zhuǎn)基因大豆整體萌發(fā)差，最高僅5%的萌發(fā)率，但由于萌發(fā)數(shù)量較少，不再做進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

表11 轉(zhuǎn)基因玉米光照/黑暗培養(yǎng)萌發(fā)數(shù)差異顯著性分析

4 結(jié)果與討論

盡管進(jìn)境糧食攜帶雜草種子的截獲率較高，但截獲的大多數(shù)雜草種子數(shù)量不能滿足試驗(yàn)需求，無(wú)法對(duì)截獲的多數(shù)雜草種子進(jìn)行分析，因此選取綠穗莧、三葉鬼針草、裂葉牽牛等3種外來(lái)雜草種子作為供試對(duì)象，進(jìn)行生活力測(cè)定研究。

本研究中3種雜草生活力對(duì)光照不敏感，但對(duì)溫度較敏感，3種雜草在22.5℃溫度條件下培養(yǎng)萌發(fā)率最高，其萌發(fā)勢(shì)均保持在較高水平，說(shuō)明進(jìn)境糧食攜帶的雜草生活力強(qiáng)，外來(lái)雜草入侵風(fēng)險(xiǎn)較大；試驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆均具有明顯的生活力，尤其是轉(zhuǎn)基因大豆雖在進(jìn)境前做了滅活處理，但試驗(yàn)結(jié)果表明，大規(guī)模滅活處理并不能達(dá)到100%的滅活效果，仍然有1.7%以上的萌發(fā)率和萌發(fā)勢(shì)，存在轉(zhuǎn)基因逃逸的風(fēng)險(xiǎn)。因此加強(qiáng)口岸檢疫時(shí)嚴(yán)格檢疫處理措施是防止外來(lái)有害生物入侵和轉(zhuǎn)基因逃逸的最有效的手段。