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HPLC法測定壺瓶棗中環(huán)磷酸腺苷含量的研究

2019-05-27 12:24:52苗瀲涓侯艷霞郝瑞芳宿炳林盧桂賓
山西林業(yè)科技 2019年1期
關(guān)鍵詞:磷酸二氫鉀腺苷色譜法

苗瀲涓,侯艷霞,郝瑞芳,宿炳林,盧桂賓,白 斌

(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西 太原 030009)

壺瓶棗是山西省太谷縣特產(chǎn),藥食同源植物,中國國家地理標志產(chǎn)品。據(jù)報道,環(huán)磷酸腺苷(cAMP)在棗中的含量是現(xiàn)在所有已測動植物材料中最高的。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)具有緩解抑郁癥、消化功能障礙,調(diào)節(jié)肝功能,放松平滑肌、擴張血管,激活蛋白等作用。常用的cAMP檢測方法有蛋白免疫結(jié)合法、高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法等。本試驗以壺瓶棗為研究對象,采用酶解浸提法,提高壺瓶棗中cAMP的提取量,建立了檢測壺瓶棗中cAMP含量的高效液相色譜法。該方法快捷準確,可為以后研究不同時期cAMP含量變化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與藥品

試驗材料為壺瓶棗,采自山西省農(nóng)科院果樹所國家棗種質(zhì)資源圃。

藥品為甲醇(色譜級,4 L,北京迪科馬科技有限公司);纖維素酶(阿拉丁,25 g);環(huán)磷酸腺苷標準品(cAMP,純度>99.0%,上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司);檸檬酸、磷酸二氫鉀(分析純,天津化學(xué)試劑三廠)。

1.1.2 試驗儀器

高效液相色譜儀(Skyray Instrument);高速冷凍離心機(eppendorf, centrifuge 5810R);鼓風干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);超純水機(北京普析通用儀器有限責任公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DB型)。

1.2 方法

1.2.1 定量工作曲線

精確稱取100 mg cAMP標準品定容至100 mL,配制成1 mg/mL的標準儲備液,于4 ℃冷藏保存。分別配制成濃度為10 μg/mL,20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL的cAMP溶液,制作標準曲線。

1.2.2 樣品預(yù)處理

選取大小均勻的壺瓶棗清洗干凈,切成細條,放入55 ℃烘箱中烘干,然后粉碎過50目篩,制備成干棗粉樣品。準確稱取1.000 0 g棗粉,用熱水溶解,在60 ℃溫水浴中浸提1 h,取出后冷卻至室溫,用0.1 mol/L檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0.按照1∶100的質(zhì)量比加入纖維素酶,于45 ℃水浴45 min,然后超聲波浸提20 min,取出后定容至50 mL離心管。設(shè)置溫度4 ℃,轉(zhuǎn)速4 000 r/min,離心10 min,用 2 mL注射器吸取樣液過0.45 μm有機系濾膜,打入進樣瓶待測。

1.2.3 色譜條件

采用Sino Chrom ODS-BP色譜柱(5 μm,4.6 mm×200.0 mm),柱溫為30 ℃,流動相為磷酸二氫鉀溶液-甲醇(80 ∶20,過0.45 μm 有機系濾膜,超聲脫氣),流速為1 mL/min.進樣量為10 μL,檢測波長為259 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

環(huán)磷酸腺苷易溶于甲醇-磷酸二氫鉀溶液或甲醇-水溶液,因此,本試驗選擇這2種混合溶液分別作為流動相進行對比研究。結(jié)果表明,甲醇-磷酸二氫鉀溶液洗脫固定相上吸附的化合物效果更好,而且相近保留時間的組分液不容易分開。進一步優(yōu)化流動相比例,分別比較甲醇-磷酸二氫鉀溶液(10 ∶90)、甲醇-磷酸二氫鉀溶液(20 ∶80)、甲醇-磷酸二氫鉀溶液(30 ∶70),結(jié)果表明,甲醇-磷酸二氫鉀溶液(20 ∶80)待測組分分離效果好,分析時間為5 min左右,符合快速檢測要求。環(huán)磷酸腺苷標準品譜圖見圖1.

2.2 標準曲線的制作

用超純水稀釋1 mg/mL的標準儲備液,分別配制成10 μg/mL,20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL 濃度溶液,以檢測峰面積為橫坐標,濃度為縱坐標繪制標準曲線,結(jié)果見圖 2.

圖1 環(huán)磷酸腺苷標準品HPLC譜圖

圖2 環(huán)磷酸腺苷標準曲線

環(huán)磷酸腺苷在10.0 μg/mL~50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi),濃度和檢測峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.000 320 10x,相關(guān)系數(shù)為 0.999 076 28.

2.3 實際樣品的測定

用本試驗建立的方法測定山西太谷壺瓶棗樣品20份,檢測出環(huán)磷酸腺苷含量在129.92 μg/g~474.19 μg/g之間。

3 結(jié)論

本試驗建立了壺瓶棗中環(huán)磷酸腺苷測定的高效液相色譜法。這種方法具有操作簡單,重復(fù)性好,選擇性好,專一性強等優(yōu)勢。同時,對提取方法的優(yōu)化也提高了環(huán)磷酸腺苷的提取量,可為后續(xù)研究不同品種、不同時期棗中環(huán)磷酸腺苷含量的變化提供方法基礎(chǔ)。

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