沈丹丹 ，許 娟 ，姜學美 ，肖 波 △

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121； 3.重慶仁澤醫(yī)藥科技有限公司，重慶 400021）

環(huán)索奈德是由ALTANA Pharma AG開發(fā)的適用于支氣管哮喘和過敏性鼻炎的皮質(zhì)類固醇，為前體藥物，鼻內(nèi)給藥的環(huán)索奈德被鼻黏膜內(nèi)的酯酶水解成具有生物學活性的代謝產(chǎn)物-去異丁?；h(huán)索奈德［1-7］。由Nycomed公司開發(fā)的水性鼻噴霧劑在加拿大、阿根廷、巴西、墨西哥、香港、韓國、馬來西亞上市，由Sunovion公司在美國上市，商品名Omnaris，用于治療成人和12歲以上兒童季節(jié)性和常年性過敏性鼻炎所引起的鼻部癥狀。目前，國內(nèi)尚無環(huán)索奈德鼻噴霧劑上市。根據(jù)Omnaris美國藥品說明書公布［8］的本品處方信息，含有防腐劑山梨酸鉀和防腐增效劑依地酸二鈉，其用量分別為0.12% 和 0.01% （w／w），根據(jù)美國食品藥物管理局（FDA）藥品評價與研究中心（CDER）的行業(yè)指南文件《鼻腔噴霧劑，吸入溶液、混懸液，及噴霧藥品-化學、制造及控制文件》（CMC），若處方中使用了防腐劑、抗氧劑、螯合劑或其他穩(wěn)定劑（如苯扎氯銨、苯乙醇、依地酸鹽），應對這些成分進行專屬性含量測定，并制訂驗收標準。本研究中建立了一種同時測定山梨酸鉀和依地酸二鈉含量的色譜方法，逆向解析產(chǎn)品中防腐劑用量，為本品的處方工藝研究提供依據(jù)，同時保證產(chǎn)品的安全性、有效性及可控性。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；K51502653型電子天平（德國賽多利斯＜中國＞有限公司）。

1.2 試藥

山梨酸鉀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 101075-201602，含量為 99.7%）；依地酸二鈉（南京化學試劑股份有限公司，批號為20161104，含量為99.0% ）；環(huán)索奈德鼻噴霧劑（商品名 Omnaris，Sunovion制藥有限公司，批號為183844，規(guī)格為每瓶12.5 g）；硼砂、硫酸銅為分析純，乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil? ODS-3 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.02 mol／L 硼砂溶液（10 ∶90）；檢測波長：288 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；進樣量：20 μL。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取樣品2.0 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加0.1%CuSO4溶液 0.5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，離心，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取依地酸二鈉對照品約40 mg、山梨酸鉀對照品約481 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取 5.0 mL，加 0.1%CuSO4溶液1 mL，再用水稀釋至50 mL，搖勻，即得每1 mL約含依地酸二鈉8 μg和山梨酸鉀96 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：按照處方工藝配制混合輔料，精密量取輔料適量，按2.2項下供試品溶液制備方法配制輔料空白溶液；吸取 0.1%CuSO4溶液 0.5 mL，用水稀釋至25 mL，搖勻，即得空白溶劑。精密量取續(xù)濾液20 μL注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖（圖1）。在此條件下，空白溶劑、輔料空白溶液不干擾依地酸二鈉和山梨酸鉀的測試，依地酸二鈉和山梨酸鉀之間的分離度遠大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000，專屬性良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液20 μL，平行6針，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果依地酸二鈉和山梨酸鉀峰面積的RSD分別為1.1%和1.4%（n＝6）。

線性關系考察：取依地酸二鈉對照品約0.04 g和山梨酸鉀約0.48 g，精密稱定，加水溶解并稀釋至同一500 mL容量瓶中，搖勻，作為依地酸二鈉與山梨酸鉀對照品貯備液。精密吸取依地酸二鈉與山梨酸鉀對照品貯備液 2，3，4，5，6，7，8 mL，加 0.1%CuSO4溶液 1 mL，再用水稀釋至50 mL，搖勻，即得系列對照品溶液。精密吸取對照品溶液系列各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程，依地酸二鈉為A＝7.675 6C+0.253 6（r＝0.999 9），山 梨 酸 鉀 為A＝5.713 6C+20.477 9（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，依地酸二鈉進樣質(zhì)量濃度線性范圍是 3.209 6 ～12.838 4 μg／mL，山梨酸鉀進樣質(zhì)量濃度線性范圍是 38.46 ～153.82 μg／mL。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下同一供試品溶液，分別于0，6，12，18，24 h 時吸取 20 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果記錄色譜圖，依地酸二鈉和山梨酸鉀峰面積的RSD分別為 0.91%和 0.48% （n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

重復性試驗：取樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，依法進樣測定。結(jié)果依地酸二鈉與山梨酸鉀的平均含量分別為0.010 1%和0.119 9%，RSD分別為 0.7%和 1.1% （n＝6）。

定量限與檢測限確定：取依地酸二鈉和山梨酸鉀對照品適量，精密稱定，按2.2項下方法制備每1 mL中約含依地酸二鈉8 μg和山梨酸鉀96 μg的對照品溶液。精密量取1.0 mL，用水逐級稀釋成系列濃度，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比（S／N）為3∶1計算檢測限，以S／N為10∶1計算定量限。結(jié)果依地酸二鈉和山梨酸鉀檢測限分別為7.2 ng和5.0 ng，定量限分別為 24.0 ng 和 16.4 ng。

加樣回收試驗：精密稱取依地酸二鈉對照品約0.04 g和山梨酸鉀約0.48 g，加水溶解并稀釋至同一500 mL容量瓶內(nèi)，搖勻，作為依地酸二鈉與山梨酸鉀對照品貯備液。精密稱取樣品輔料空白約2 g，平行9份，分別置25 mL容量瓶中，3份加入依地酸二鈉和山梨酸鉀對照品貯備液1.0 mL，3份加入依地酸二鈉和山梨酸鉀對照品貯備液2.5 mL，3份加入依地酸二鈉和山梨酸鉀對照品貯備液 4.0 mL，再分別加 0.1%CuSO4溶液0.5 mL，用水稀釋至25 mL，搖勻，離心，用微孔濾膜濾過，棄去前濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測定記錄色譜圖，計算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 耐用性試驗

色譜柱：選用AgilentEcplisePlus-C18柱及Inertsil?ODS-3 C18柱對供試品溶液進行測定，其他條件保持不變。結(jié)果不同種類的色譜柱對分離度無明顯影響，依地酸二鈉與山梨酸鉀平均含量分別為0.010 0%和0.119 4%，表明所選色譜柱耐用性強。

流動相比例：選用色譜柱Inertsil? ODS-3 C18柱，改變流動相比例，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，測定。結(jié)果乙腈在±5%變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明流動相比例耐用性強。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

流速：將流速分別設定為 0.8，1.0，1.2 mL ／min，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，測定。結(jié)果流速在 0.8～1.2 mL ／min 范圍內(nèi)變化，分離度均大于2.0，表明流速耐用性強。

0.1%CuSO4溶液加入量：取本品，分別將供試品溶液配制過程中的0.1%CuSO4溶液的加入量設定為0.25，0.50，1.00 mL，其他條件不變，按擬訂色譜條件，取20 μL注入液相色譜儀，測定。結(jié)果依地酸二鈉平均含量分別為 0.010 1%，0.010 1%，0.010 0%，RSD為0.6% （n＝3）；山梨酸鉀平均含量為 0.1206%，0.1205%，0.119 7% ，RSD為 0.4% （n＝3）?？梢?，加入 0.25～1.00 mL的0.1%CuSO4溶液均能完全絡合樣品中的依地酸二鈉，對測試結(jié)果無影響。

柱溫：將柱溫分別設定為20，25，30℃，其他條件保持不變，取2.2項下供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，測定。結(jié)果柱溫在20～30℃范圍內(nèi)變化，分離度均大于2.0，表明柱溫耐用性強。

2.5 影響因素試驗

高溫：取樣品分為正立和倒立放置，分別于40℃和60℃放置10 d，于第5天和第10天取樣，作為高溫40℃和60℃的破壞樣品。

高濕：取樣品分為正立和倒立放置，分別于（92.5±5）%相對濕度下放置10 d，于第5天和第10天取樣，作為高濕破壞樣品。

光照：取樣品去除鋁塑外包裝（為棕色瓶包裝），分為正立和倒立放置，于（4 500±500）lx光照箱中放置10 d，于第5天和第10天取樣。另取本品，將噴霧劑藥液轉(zhuǎn)移出棕色瓶，裝入無色透明的玻璃容器內(nèi)，橫放于（4 500±500）lx光照箱中，于第5天和第10天取樣。以上2種條件下的樣品均作為光照破壞樣品。

表2 高溫試驗測定結(jié)果（%）

表3 光照試驗測定結(jié)果（%）

將破壞后的樣品按2.2項下方法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖。與未經(jīng)破壞的防腐劑含量測定結(jié)果比較，詳見表2至表4。結(jié)果表明，與0 d比較，高溫及高濕條件下，依地酸二鈉與山梨酸鉀含量均無顯著變化，質(zhì)量穩(wěn)定，說明對高溫及高濕不敏感，包裝密封性好；在無色透明玻璃容器內(nèi)進行的光照試驗中，防腐劑山梨酸鉀含量降低，說明樣品對光敏感，應采用避光包裝；光照試驗中，依地酸二鈉與山梨酸鉀含量無顯著變化，質(zhì)量穩(wěn)定，說明棕色瓶避光包裝有利于本品的穩(wěn)定。

表4 高濕試驗測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 流動相選擇

流動相的篩選是參照文獻［9］中288 nm波長測定。通過紫外光譜（UV）掃描可知，依地酸二鈉UV吸收很弱，無法測試，與銅絡合后生成乙二胺乙酸銅鈉（EDTA-Cu），在200～300 nm波長范圍內(nèi)均有較強吸收。山梨酸鉀在255 nm波長有最大吸收，吸收很強，在288 nm波長處有一定吸收，本研究選擇288 nm作為山梨酸鉀和依地酸二鈉的檢測波長。本研究中對0.1%CuSO4溶液的加入量進行了考察，結(jié)果表明，在加入0.25 ～1.00 mL 的 0.1%CuSO4溶液均能完全絡合樣品中的依地酸二鈉，對測試結(jié)果無影響。本研究建立的色譜條件能同時測定山梨酸鉀和依地酸二鈉的含量，縮短分析時間，2個主峰均有效洗脫，并與相鄰峰分離良好。

3.2 影響因素試驗

在高溫及高濕條件下，隨著時間的增加，山梨酸鉀和依地酸二鈉含量均無明顯變化；在光照條件下，棕色瓶包裝的依地酸二鈉與山梨酸鉀含量無顯著變化，質(zhì)量穩(wěn)定，將環(huán)索奈德鼻噴霧劑藥液裝入無色透明的玻璃容器內(nèi)進行光照試驗，防腐劑山梨酸鉀含量降低，說明本品對光敏感，應采用避光包裝。

環(huán)索奈德鼻噴霧劑處方中含有防腐劑山梨酸鉀和防腐增效劑依地酸二鈉，其用量分別為0.12%和0.01%（w／w），本研究建立了專屬性的含量測定方法，結(jié)果表明國外上市樣品中山梨酸鉀均在標示量（0.12%，g／g）的90%（0.108% ，w／w）～110%（0.132%，g／g）范圍內(nèi)，依地酸二鈉均在標示量（0.01%，g／g）的 90%（0.009%，g／g）～110% （0.011% ，g ／g）范圍內(nèi)。國內(nèi)企業(yè)研發(fā)該品種時應加強對處方防腐劑的質(zhì)量控制，從而使產(chǎn)品處方、質(zhì)量水平與原研產(chǎn)品達到一致，彌補該品種在國內(nèi)市場的空白。